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《沉香隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna反應(yīng)體系的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、沉香隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA反應(yīng)體系的建立：邵敏周鶴峰唐歷波劉銀花李官成【摘要】 目的對(duì)影響沉香隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）反應(yīng)的各因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適用于沉香RAPD的最佳反應(yīng)體系。方法采用改良的CTAB法提取基因組DNA，變化單一因素的方法對(duì)模板DNA濃度、Taq酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度對(duì)RAPD影響進(jìn)行分析。結(jié)果建立了適合沉香RAPD分析的最佳反應(yīng)體系：在20μl反應(yīng)體系中，模板DNA用量20ng、Taq酶1.0U、dNTPs濃度為0.3～0.4mmol·L-1、隨機(jī)引物濃度為0.6μmol·L-1、Mg2+濃度1.5～2
2、.0mmol·L-1。PCR反應(yīng)條件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45個(gè)循環(huán)，72℃，8min。結(jié)論該反應(yīng)體系具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。【關(guān)鍵詞】沉香；RAPD；基因組DNA；反應(yīng)體系 Abstract：ObjectiveToestablishtheoptimumRAPDreactionsystemofAquilariaagallochaRoxb.MethodsThegenomicDNAAquilariaagallochaRoxb.bymodifiedCTABmethod,andthedifferentTemp
3、lateDNA,Taq,dNTPs,Primer,Mg2+，theannealingtemperatureizedreactionsystemandprogramofRAPDforAquilariaagallochaRoxb.edinavolumeof20μl，erase,0.3～0.4mmol·L-1dNTPs,0.6μmol·L-1randomPrimer,1.5～2.0mmol·L-1Mg2+.Afterpre-denaturingat94℃for10min,undertheconditionofdenaturingat94℃for1min,annea
4、lingat36℃for1min,extensionat72℃for2min,amplifyingfor45cycles,finallyextensionat72℃for8min.ConclusionThereactionsystemisreproducibleandhighlystable. KeyicDNA;Reactionsystem 沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹(shù)脂的木材［1］，是一種熱帶亞熱帶常綠喬木。白木香是我國(guó)生產(chǎn)沉香藥材唯一的植物資源，主要分布于廣東省東南部、西南部、中部以南地區(qū)和海南
5、，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生植物。沉香是臨床常用的理氣藥，具行氣止痛、溫中止噯、納氣平喘功效，用于治療胸腹脹痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，建國(guó)至今有一千六百多個(gè)藥方使用沉香；另外，沉香樹(shù)是很好的園林綠化樹(shù)種，又是珍貴的天然香料。長(zhǎng)期以來(lái)由于森林資源、生態(tài)環(huán)境遭受災(zāi)害和人為破壞，天然沉香資源日趨枯竭。在現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料中，對(duì)白木香的研究主要集中在組織培養(yǎng)和化學(xué)成分等方面，遺傳學(xué)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！ ‰S機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)是1990年由gCl2、隨機(jī)引物、瓊脂糖、CTAB、ED
6、TA、巰基乙醇購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司；DNAMarker由大連寶生物公司提供。Hema-8000型PCR儀（珠海黑馬儀器廠）、島津UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；DYC型電泳儀（北京六一儀器廠）；5810R型冷凍高速離心機(jī)（eppendorf）?！ ?.3DNA提取與檢測(cè)采用改良的CTAB法提取基因組DNA［3］。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品在230，260，280nm處吸光度；0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA片段大小和完整性，觀察并拍照?！ ?.4PCR擴(kuò)增和RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化參考陳大霞等［3］的方法，擴(kuò)增反應(yīng)在Hema-8000型
7、PCR儀上進(jìn)行。在RAPD分析之前，為了確定沉香基因組DNA最佳擴(kuò)增條件，分別研究了模板DNA濃度、Taq酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度對(duì)RAPD反應(yīng)的影響，采用保持與其他因素一致的條件下，變化單一因素從而篩選最佳濃度，找出適合沉香RAPD反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。PCR擴(kuò)增基本體系為：在20μl反應(yīng)體系中，含模板DNA15ng、Taq酶1.0U、dNTPs0.3mmol·L-1、隨機(jī)引物0.2μmol·L-1、Mg2+1.5mmol·L-1。PCR反應(yīng)條件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45個(gè)循環(huán)
8、，72℃，8min。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 1.
