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《正交設計優(yōu)化茴香隨機擴增多態(tài)dna反應體系的研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、正交設計優(yōu)化茴香隨機擴增多態(tài)DNA反應體系的研究論文李海渤，王羽梅，何金明【摘要】目的建立茴香的隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）最佳反應體系。方法正交設計及方差分析應用于建立RAPD反應體系的研究。結果茴香的RAPD最佳反應體系為25μl的反應體系中，含10×Buffer2.5μl，2.0mMdNTPs3.0μl，2.0U/μlTaq酶1.0μl，2.0μmol/L隨機引物4.0μl，30.0ng/μl模板DNA30ng.freelalRAPDreactionsystemofFennel.MethodsTheorthogonald
2、esignandvarianceanalysisizetheRAPDsystem.ResultsTheoptimalFennelRAPDsystemmol/L),1.0μlTaqE(2.0U/μl),4.0μlPrimer(2.0μmol/L),.freel.ConclusionTheorthogonaldesignandvarianceanalysiscanbeusedtooptimizetheRAPDsystem.Key;Varianceanalysis茴香FoeniculumvulgareMil1.為傘形科茴香屬多年生宿根
3、草本植物，原產地中海沿岸及西亞，在我國北方各地被廣泛栽培。茴香的莖、葉、種子都含有揮發(fā)油，其主要成分為茴香醚及茴香酮，具有特殊的香味。我國北方主要把茴香作調味品或餡食。其果實可作香料及藥用，有溫肝腎、暖胃氣、散寒結的作用［1］。隨機擴增多態(tài)DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)標記是由g2+）2.5μl，其余組分［TaqDNA聚合酶、dNTPs（北京鼎國生物技術有限責任公司提供）；引物（北京奧科生物技術有限責任公司提供）；DNA］按表1稀釋并添加，再用ddH2O將體系補至25.0μl。表
4、1RAPD反應體系的正交設計及擴增結果（略）1.3PCR擴增與產物檢測在FTH-04AB-102型PCR儀（杭州大和熱磁電子有限公司）上進行擴增，熱循環(huán)參數為95℃預變性3min，94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。擴增產物在1.0％(arker，經EB染色。在hnageMasterVDS凝膠成像系統(tǒng)上成像檢測，照相并存盤。1.4數據分析統(tǒng)計每個處理擴增后DNA片段數目，并參照Marker電泳片段的亮度對處理所得片段亮度進行打分，打分標準為：片段亮度大于等于
5、21228bp片段，分值為5分；片段亮度介于5146～3530bp片段之間，分值為4分；片段亮度介于2027～1904bp片段之間，分值為3分；片段亮度介于1584～1375bp片段之間，分值為2分；片段亮度低于1375bp片段，分值為1分。平均片段亮度＝某處理片段亮度得分總和/某處理片段總數。對所得片段數目及亮度兩個結果分別進行方差分析及SSR法各因素水平間多重比較，獲得較好的反應體系。1.5最佳反應體系的驗證為驗證最佳反應體系的穩(wěn)定性，采用多個引物對多個茴香材料進行RAPD擴增，觀察其重復性及穩(wěn)定性。2結果2.1正交設計的處
6、理結果及分析選用引物P41（GTTTCGCTCC）按表1設計對內蒙古茴香進行RAPD擴增（見圖1，表1）。分別對表1擴增片段數量及擴增片段亮度進行方差分析。結果見表～3。2.1.1擴增片段數量從表2可知，MSe1/MSe2＝1.26≤F0.05（8，24）＝2.36，說明實驗因素之間差異不顯著，即實驗因素之間無交互作用。故將模型誤差MSe1與試驗誤差MSe2合并，得MSe＝（SSe1＋SSe2）/（dfe1＋dfe2）＝1.84，進行方差分析。F檢驗結果表明，dNTPs（A）、隨機引物（C）因素對擴增片段數量有極顯著影響，而Ta
7、q酶（B）、模板DNA（D）因素對擴增片段數量影響不顯著，區(qū)組間差異不顯著。模型誤差MSe1不顯著，說明試驗因素間交互作用不顯著，經SSR法多重比較表明，A因素第2至第5水平均與第1水平平均擴增片段數間差異極顯著，第2至第5水平之間差異不顯著；B因素第4水平與第1水平之間平均擴增片段數間差異顯著，其余各水平間差異不顯著；C因素第4，5水平結果相同，均與第1，2水平間差異極顯著，與第3水平間差異不顯著；D因素第1水平與其余4個水平間差異顯著或極顯著。綜上所述，各因素的最優(yōu)水平為A2至A5，B2至B5，C4或C5，D1。圖1反應體系
8、的正交設計擴增結果（略）2.1.2擴增片段亮度擴增片段亮度的方差分析結果與擴增片段數量方差分析結果相似（見表3），MSe1/MSe2＝1.39≤F0.05（8，24）＝2.36，說明試驗因素之間差異不顯著，即試驗因素之間無交互作用。故將模型誤差MSe1與試驗誤差
