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1、T細胞受體基因轉導及應用的研究進展作者：牟艷芳張文峰邵紅偉黃樹林【關鍵詞】T細胞受體免疫治療基因轉導近年來研究發(fā)現，針對特異性抗原的過繼性免疫治療對于包括腫瘤在內的很多疾病是一種很有潛力的治療方法。T細胞識別抗原的特異性主要由T細胞受體（TCR）決定的，TCR基因轉導為腫瘤的過繼免疫治療提供了新途徑。通過轉導某些疾病相關抗原反應性T細胞克隆的TCR基因，使人外周血淋巴細胞具有針對其相關抗原的靶向性，在疾病治療方面取得了一定的成效?！ 細胞受體（TCR）是T細胞表面能夠識別和結合蛋白質抗原的特異性受體。當機體受到腫瘤抗原刺激時，由TCR對APC呈遞的靶細胞表面抗原肽MHC復合
2、物進行認知來識別抗原。由抗原識別所引發(fā)的細胞毒作用或對細胞殺傷效應主要是由CD8+T細胞和NK細胞實現的，而T細胞表面的TCR和CD3分子組成的TCR復合物與腫瘤細胞的MHC抗原肽結合，為T細胞活化提供了第一信號?！ 鹘y(tǒng)用于過繼性免疫治療的腫瘤抗原特異性的T細胞主要來自于TIL或病人PBMC中分離的CTL單克隆，但是在體外培養(yǎng)T細胞單克隆是非常費力的工作，而且常不能達到所需要的治療量［1］。近年來，由于相繼分離出腫瘤相關抗原和腫瘤抗原特異性TCR基因［2］，這使通過轉導TCR基因產生抗原特異性T細胞成為可能，也為得到有治療價值的T細胞提供了有利的手段?！ ?TCR基因的轉導
3、技術 1．1病毒載體系統(tǒng) 利用病毒載體將TCR基因轉導至T淋巴細胞，可以得到較高的轉導效率，目前主要采用的病毒載體有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。目前在TCR基因轉導過程中最常用的是以逆轉錄病毒作為載體。 逆轉錄病毒載體是第一個被允許用于臨床的載體［3］,也是廣泛用于實驗室研究和臨床試驗的載體。目前較常用的逆轉錄病毒載體為Moloney小鼠白血病病毒改建的各類逆轉錄病毒載體。這種基因載體宿主細胞廣泛,能高效地感染分裂期細胞且能整合到基因組中獲得穩(wěn)定而長期的表達。理論上它能轉染幾乎100%的靶細胞,但實際的轉染效率遠低于此［4］?！ 〗陙砗芏嘌芯咳藛T通
4、過改良已經提高了其轉染效率。如Scholten［5］等密碼修飾通過改變人TCR的α，β鏈恒定區(qū)基因，然后通過逆轉錄病毒載體LZRS轉進CD8+T細胞。通過基因修飾的TCR的α，β基因與野生型的TCR的α，β基因在CD8+T細胞中的表達比較，發(fā)現前者比后者的膜表達水平顯著提高。此外在4個月內轉染的TCR基因可穩(wěn)定的表達且保持較高的活性。Engels等［6］利用逆轉錄病毒載體將TCRαβ基因轉導人初始T細胞，發(fā)現在相同的病毒滴度下，以MPSV為基礎載體比以MLV為基礎的載體有高轉染效率和高TCR表達。此外一些構建的其他載體例如pCMMPIRESGFP,當TCR基因嵌合體插入載體中，
5、與傳統(tǒng)的載體相比，病毒滴度由6.43×109VP/L上升到2.15×1011VP/L,轉染效率由5%～10%上升到50%～60%［7］。但逆轉錄病毒只能感染分裂期細胞，容納外源基因的DNA片段長度不超過8kb，病毒滴度低，不能純化，而且整合過程中可能引起插入突變，從而引起癌變。 腺病毒載體是一種線性雙鏈DNA無包膜病毒。其有廣宿主性，可感染分裂和非分裂終末細胞。與逆轉錄病毒載體相比，外源基因的容納量大，最高可達36kb，純化和濃縮,滴度高，其DNA不能整合于靶細胞DNA中，潛在的致癌危險小?！ raciak和Pedersen等通過重組腺病毒載體短暫表達TCRVβ8.2基
6、因用于治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎［8］。腺病毒基因組不能整合到宿主細胞基因組上,不能持續(xù)表達,外源基因易隨著細胞分裂或死亡而消失,表達時間短暫,治療中需反復轉導。除此以外,容易引起機體的毒性反應和致死性的免疫反應，導致細胞溶解?！ ÷《据d體克服了逆轉錄病毒載體的一些缺陷，近年來成為新的研究熱點。慢病毒屬逆轉錄病毒之一,包括人艾滋病毒、猴艾滋病毒、羊Visna/Maedi病毒等7個亞屬。其中最令人關注的是以HIVⅠ為基礎構建的。慢病毒載體既可以轉染處于有絲分裂活躍期的細胞,又可以轉染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞，轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)免疫反應等
7、優(yōu)點?！ oseph［9］等利用慢病毒載體轉導TCRαβ基因至JurKat/MA細胞系，通過用啟動子hPGK或SFFV調節(jié)，轉導效率高達85%。Tsuji等通過慢病毒載體將識別Cs，轉導后CD4+和CD8+T細胞中β基因表達明顯增加，轉導效率明顯較高［10］。但慢病毒用作基因治療載體仍有一定的缺陷，如毒力恢復、垂直感染等安全問題。 1．2理化轉染技術 基于對應用病毒載體的生物安全性考慮,目前正試圖找到某些基因治療的替代途徑,如通過理化轉染技術，其對目的基
