高效液相色譜熒光紫外法測定動物肌肉組織中多類藥物殘留論文

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1、高效液相色譜熒光紫外法測定動物肌肉組織中多類藥物殘留論文李存江海洋吳銀良王戰(zhàn)輝趙思俊【摘要】建立了同時檢測動物肌肉組織中9種喹諾酮類藥物、7種磺胺類藥物和甲氧芐啶的高效液相色譜檢測方法。動物肌肉組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，HLB固相萃取柱凈化，洗脫液用氮氣吹至近干，磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，以甲酸水溶液乙腈體系為流動相，梯度洗脫，熒光紫外檢測器串聯(lián)測定。本方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)r0.9987;平均回收率為70.6%～103.4%.freelides，SAs)都屬于人工合成的抗菌藥物，因其抗菌譜廣而廣泛用于預(yù)防和治療食品動物的多種感染性疾病。甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)作為一種

2、抗菌增效劑，可以增強QNs和SAs的抗菌作用，常與其配合使用1。這些藥物在獸醫(yī)臨床廣泛和大量的使用必然會導(dǎo)致其在動物性食品中的殘留，嚴重危害人類的健康。我國和歐盟都已制定了多種QNs和SAs在動物組織中的最高殘留限量2,3。QNs或SAs在動物組織中與高效液相色譜(HPLC)串聯(lián)的檢測方法主要有紫外法(UV)4～7、熒光法(FLU)8,9和質(zhì)譜法(MS)10～12。國家標準中，檢測豬和雞組織中QNs殘留的HPLC方法的檢出限為20μg/kg13，SAs殘留的HPLC方法的檢出限為10～20μg/kg14。為提高檢測效率，多類(multiclass)殘留檢測,即一個方法可以同時檢測兩類以上的藥

3、物，已成為發(fā)展趨勢15～17。但有些方法靈敏度較差17，或儀器價格昂貴不易推廣應(yīng)用16，或檢測藥物較少15,17，而且不能同時測定TMP15～17，甚至在提取和凈化中使用大量的毒性高的有機溶劑，如使用氯制劑5,7,9。本研究建立了同時檢測動物肌肉組織中9種QNs、7種SAs和TMP的HPLC檢測方法。組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，固相萃取柱凈化，方法簡便、通用性強、有機溶劑用量少。2實驗部分2.1儀器與試劑RP18(150mm×3.9mm，i.d.，5μm，美國P用UV檢測器檢測。3結(jié)果與討論3.1色譜條件的選擇由于結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的差異，同時檢測和分離兩類以上結(jié)構(gòu)不同藥物對色譜條件要求較高。本研

4、究分別對多種型號和規(guī)格的色譜柱進行考察和比較，采用SymmetryShildTMRP18色譜柱可成功分離QNs、SAs和TMP。QNs和SAs均為兩性化合物，流動相酸度對其分離影響很大，而且QNs在酸性溶液中有較強熒光發(fā)射18。本實驗采用甲酸水溶液乙腈體系為流動相，對不同濃度甲酸的分離效果進行了比較，降低甲酸的濃度會導(dǎo)致QNs的色譜峰拖尾，而且3類藥物不能完全分離，最終選擇0.1%甲酸乙腈體系作為流動相。通常，SAs和TMP使用UV檢測器，而QNs常使用FLU檢測器，且不同的QNs的熒光光譜又相差較大。本實驗采用常規(guī)的UV檢測器串聯(lián)程序波長FLU檢測器測定樣品，一次進樣可以同時檢測3類藥物

5、，而且都能獲得較高的靈敏度。程序FLU檢測波長見2.2項。FLU和UV檢測器各藥物的色譜峰尖銳、對稱(見圖1)。圖1標準品色譜圖(a,d,g,j);豬肉添加色譜圖(b,e);空白豬肉色譜圖(c,f);雞肉添加色譜圖(h,k);空白雞肉色譜圖(i,.freel)1.甲氧芐啶(trimethoprim);2.麻保沙星(marbofloxacin);3.磺胺嘧啶(sulfadiazine);4.氧氟沙星(ofloxacin);5.磺胺吡啶(sulfapyridine);6.磺胺噻唑(sulfathiazole);7.環(huán)丙沙星(ciprofloxacin);8.洛美沙星(lomefloxacin);9

6、.單諾沙星(danofloxacin);10.恩諾沙星(enrofloxacin);11.磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine);12.沙拉沙星(sarafloxacin);13.磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine);14.磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole);15.惡喹酸(oxolinicacid);16.磺胺苯酰(bensoylsulfanilamide);17.氟甲喹(flumequine)。3.2樣品前處理條件的優(yōu)化本研究試圖減少毒性大的有機溶劑在提取和凈化中的使用，磷酸鹽緩沖液可以有效提取(氟)喹諾酮類藥物8,19，但磷酸鹽緩沖液提取組織樣品中SA

7、s的方法報道很少15。本研究考察了不同組成、不同濃度、不同pH值的多種磷酸鹽緩沖液的提取效果，最后確定采用K2HPO4KH2PO4緩沖液(pH=6.0)同時提取豬和雞肌肉中的QNs,SAs和TMP，并對提取條件進行了優(yōu)化，取得了滿意的回收率，結(jié)果見表1。多類藥物的殘留分析方法常采用較復(fù)雜的前處理過程，本研究對多種固相萃取柱進行比較，最后采用單個HLB固相萃取柱同時凈化QNs,SAs和TMP，獲得