高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中泰拉霉素殘留論文

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1、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中泰拉霉素殘留論文劉勇軍,吳銀良姜艷彬沈建忠【摘要】建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)測定豬肉樣品中新型獸藥泰拉霉素殘留的方法。樣品用V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30混合溶液提取，經(jīng)離心后用PCX固相萃取小柱凈化,以SymmetryC8色譜柱為分離柱，在串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下檢測，內(nèi)標法定量。方法的線性范圍為10～500μg/kg，檢出限為5.0μg/kg，在3個濃度水平(10，20和50μg/kg)進行添加實驗，平均回收率為9

2、3.1%～105.5%;批內(nèi)相對標準偏差為1.5%～4.6%;批間相對標準偏差為1.8%～5.6%?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜.freelycin)是一種新近上市且為動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，分子式為C41H79N3O12(分子量806)，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號公告中首次批準使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統(tǒng)疾病。具有用量少、一次給藥、低殘留、動物專用等優(yōu)點1,2。我國廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物為泰樂菌素和替

3、米考星，雖然這兩種藥物的使用效果良好，但隨著使用時間的延長，圖1泰拉霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1Structureoftulathromycin在很多地區(qū)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性3，而泰拉霉素藥效強于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產(chǎn)中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法有ELISA篩選法4、薄層色譜法5、氣質(zhì)聯(lián)用法6、高效液相色譜7～10和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等11，12。有關(guān)泰拉霉素的殘留檢測研究

4、較少13。本研究建立了以羅紅霉素(C41H76N2O15,837)為內(nèi)標的泰拉霉素的HPLCMS/MS檢測方法，方法的定量限為10μg/kg，可以滿足有關(guān)法規(guī)對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測要求，為動物組織中泰拉霉素的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。2實驗部分2.1儀器與試劑icroTMAPI高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國S1Minishaker旋渦混合器;EEVAP水浴氮氣吹干儀(美國Organomation公司);超純水器(美國MilliQ公司)。泰拉霉素標準品與羅紅霉素內(nèi)標(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4為

5、色譜純;甲酸、KH2PO4、NH3·H2O為分析純;實驗室用水為MilliQ高純水。2.2標準溶液的配制泰拉霉素標準儲備液：準確稱取泰拉霉素10.0mg，用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)定容至10mL，搖勻，置冰箱冷藏儲存，有效期3個月。內(nèi)標物羅紅霉素的配制方法同泰拉霉素。添加溶液的配制：吸取儲備液1mL于100mL容量瓶中并用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)混合液定容，再從中吸取1mL于50mL容量瓶中得添加液濃度為0

6、.2mg/L(冰箱冷藏儲存，有效期2個月)。2.3內(nèi)標物質(zhì)的確定由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的同位素內(nèi)標物質(zhì)很少,至今無泰拉霉素同位素內(nèi)標物出售。而測定大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法研究和標準修制訂一般采用外標法或者采用大環(huán)內(nèi)酯類某種結(jié)構(gòu)相似藥物作為內(nèi)標物來進行定量分析。本實驗選用一種沒有用于獸藥用途且結(jié)構(gòu)與泰拉霉素非常相似的大環(huán)內(nèi)酯類藥物羅紅霉素作為內(nèi)標,分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。圖2內(nèi)標物羅紅霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.2Structureofroxithromycinasinternalstandard2.4供試樣品溶液的制備稱

7、取2.0g組織樣品于50mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30)和適量內(nèi)標工作液，7800r/min勻質(zhì)1min后，5000r/min離心2min，收集上清液過已經(jīng)分別用3mL甲醇和3mL提取液潤洗過的60g/3L的PCX小柱，待全部過柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%氨化甲醇洗脫，50℃水浴氮氣吹干后用1mL流動相定容，進行HPLCMS/MS分析。2.5LCMS/MS分析條件SymmetryC8柱(20mm×3.9mm，5μm)

8、，流動相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱溫：30℃，進樣室溫度15℃，進樣量：10μL，流速為0.3mL/min。ESI(+);多級反應(yīng)檢測(MRM);毛細管電壓：4.2kV;錐孔電壓：20V;RF透鏡電壓：0.2V;離子源溫度：110℃;脫溶劑氣溫度：350℃;錐孔氣流速：50L/h;脫溶劑氣流速：600L/h;倍增器電壓：650V;二級碰撞氣：氬氣。3結(jié)果與討論3.1樣品的提取和凈化泰拉