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《cla對hepg2細(xì)胞脂肪堆積的影響論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、CLA對HepG2細(xì)胞脂肪堆積的影響論文.freelol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用細(xì)胞24小時，采用油紅染色、RT-PCR等方法檢測肝臟脂肪沉積、ACCmRNA表達(dá)，觀察CLA對肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響。結(jié)果CLA增加HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，50μmol·L-1CLA組細(xì)胞中紅染脂滴與對照組相比明顯增多；CLA使HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸降低，50μmol·L-1組的培養(yǎng)液中游離脂肪酸與對照組相比含量降低了50%（P0.05）；CLA增加HepG2細(xì)胞ACCmRNA的表達(dá)，A
2、CCmRNA表達(dá)水平隨CLA濃度增加而增高。結(jié)論CLA可增加HepG2細(xì)胞的脂肪沉積；其機(jī)制可能與CLA能夠改變肝細(xì)胞中ACC的表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】共軛亞油酸(CLA)HepG2細(xì)胞脂肪代謝ACC共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacids，CLA)是由一組具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸的異構(gòu)體構(gòu)成的混合物。1987年MichaelPariza研究小組分離出CLA.freelresco公司；油紅O-0625，Sigma公司，共軛亞油酸（CLA），Sigma公司；游離脂肪酸測試盒南京建成科技有限公司；TRI
3、ZOL，Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas公司葡萄糖試劑盒，上海復(fù)星公司。1.3主要儀器與設(shè)備NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差顯微鏡，YI-875SA醫(yī)用超凈工作臺，酶聯(lián)免疫檢測儀，MyCyclerthermalcycle，凝膠成像儀等。1.4引物引物由奧達(dá)公司合成，其中ACC引物為：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’-TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。β-ACTIN引物為：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGT
4、ACATGGTGGTGCC-3’。2實驗方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞置于含10％新生小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，含有100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，37℃、5％CO2、飽和濕度的恒溫孵箱條件下培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化液消化。2.2油紅O染色觀察HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積將HepG2細(xì)胞接種于放有干凈蓋玻片的6孔板內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%滿時，吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度CLA作用24小時后，終止培養(yǎng)；棄培養(yǎng)液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室溫孵育5分鐘。除去甲醛溶液
5、，加入同等體積的10%甲醛室溫孵育1小時，用錫紙包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的異丙醇沖洗，完全干燥；加入油紅O工作液放置10分鐘，除去油紅O立即用蒸餾水沖洗4次，晾干后在倒置顯微鏡下觀察。2.3染色法測定培養(yǎng)液中的游離脂肪酸將HepG2細(xì)胞以每孔5×104個細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%滿時，吸棄培養(yǎng)液，將實驗組分為1%血清的DMEM培養(yǎng)液空白對照組（無細(xì)胞），正常細(xì)胞對照組（含1%血清的DMEM培養(yǎng)液）、CLA干預(yù)組(濃度為0、10、50、100μmol
6、·L-1)，每組設(shè)3孔并列，孵箱中培養(yǎng)24小時后吸棄培養(yǎng)液，CLA干預(yù)組每孔加入1ml100nmol·L-1的胰島素溶液作用1小時后，按照試劑盒說明書方法，采用比色法測定培養(yǎng)液中游離脂肪酸的變化，同時24孔板內(nèi)細(xì)胞胰酶消化后細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。2.4胞總RNA的提取用TRIZOL試劑按操作說明書提取，提取的RNA用約25μLDEPC處理水溶解。2.5RNA純度鑒定取RNA5μL，稀釋100倍后用紫外分光光度計測定其OD260和OD280值，并計算OD260/OD280值及RNA濃度。2.6cDNA的合成（1）以提取的總
7、RNA3μg為模板，cDNA合成反應(yīng)體系為12μL，包括：提取的總RNA模板3μg，PrimerOligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水補(bǔ)至12μL。3-5sec離心混勻，65℃加熱5min后置于冰浴中。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系包括：5×RTbuffer4μL；RNaseInhibitor1μL；10mMdNTPmix2μL；ReverTraAce1μL；補(bǔ)水到20μL。3-5sec離心混勻，37℃孵育5min后冰浴。（3）加入M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，總體積為20μL。離心混勻，3-5s，42℃孵育6
8、0min。（4）70℃加熱10min以終止反應(yīng)。合成的cDNA保存于-20℃或用于擴(kuò)增。2.7PCR反應(yīng)體系10×ReactionBuffer5μL；10mMdNTPs1μL；Primer1(P1)和Primer2(P2)各20pmol；cDNA2μL；KOD-Plus1μL；H2O33μL，總體積為50μL。PCR擴(kuò)增條件為:解鏈95℃，60s；聚合55℃
