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1、CYR61/CCN1在肝細(xì)胞肝癌中的原位表達(dá)及其臨床意義丁偉，司維柯，楊景，孫世俊，巫猛，潘靜，趙宸【摘要】目的：觀察Cyr61在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)的意義.方法：采用免疫組化法和RT?PCR共檢測(cè)65例肝細(xì)胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表達(dá)水平，分析其表達(dá)與肝癌的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系.結(jié)果：高分化HCC組織的Cyr61蛋白表達(dá)水平高于低分化HCC組織(P<0.01)；鏡下存在靜脈浸潤(rùn)、多結(jié)節(jié)的HCC組織中Cyr61蛋白表達(dá)高于無靜脈浸潤(rùn)、單結(jié)節(jié)的HCC組織(P<0.05).30例肝癌組織Cyr61mRNA表達(dá)均為陽(yáng)性，86.67％（2
2、6/30）癌組織Cyr61mRNA表達(dá)低于相應(yīng)癌旁組織（P<0.05）.結(jié)論：Cyr61可能在肝癌的發(fā)生早期發(fā)揮重要作用，并與肝癌進(jìn)程中的間質(zhì)重建和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān).【關(guān)鍵詞】癌，肝細(xì)胞；Cyr61/C1；免疫組織化學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)0引言富含半胱氨酸61(Cyr61/C1)是C家族成員之一，為即刻早期基因，廣泛存在于人類多種組織器官,如胎盤、心肌、肺、腦、胰腺和結(jié)締組織等,而在胃腸道、前列腺、肝臟、腎臟中其表達(dá)相對(duì)較低［1］，是重要的細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)因子.近來研究發(fā)現(xiàn)Cyr61與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但確切關(guān)系和機(jī)制尚待闡明.我們采用免疫組化和RT
3、?PCR方法，分析Cyr61在肝細(xì)胞肝癌（HCC）和癌旁組織中的表達(dá)，并探討Cyr61與肝癌發(fā)生的關(guān)系.1材料和方法1.1材料2003?12/2005?09HCC石蠟切片35（男30，女5）例；年齡28~73（平均49.8）歲.其中高分化22例，低分化13例；結(jié)節(jié)型肝癌22例中，單結(jié)節(jié)8例，多結(jié)節(jié)14例；有鏡下靜脈浸潤(rùn)15例，無20例.存在鏡下癌栓14例，無21例.手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的標(biāo)本30例，男25例，女5例；年齡24~72（平均48.8）歲.取腫瘤及癌旁肝組織，標(biāo)本離體后迅速置于液氮中保存.Cyr61多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司，
4、免疫組化試劑盒SP?9001/9002為北京中杉公司產(chǎn)品.RNA抽提試劑Tripure為Gibco公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑Revertra購(gòu)自Toyobo公司，Cyr61，GAPDH引物均由Invitrogen公司合成，焦碳酸二乙脂(DEPC)為Sigma公司產(chǎn)品，2xTaqPCRMasterMix12.5μL購(gòu)自天根生物.1.2方法1.2.1Cyr61蛋白檢測(cè)采用免疫組化SP法.Cyr61工作液由PBS1∶100稀釋.用0.01μmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)熱修復(fù)方法進(jìn)行抗原修復(fù).陰性對(duì)照以PBS代替一抗.山羊鏈霉素抗生物素?過氧化酶
5、連接法(SP)試劑盒檢測(cè)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色.組織結(jié)構(gòu)及背景清晰，所測(cè)組織中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性（+），不著色者為陰性(-).定量測(cè)定用NIS?Elements圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)所有Cyr61陽(yáng)性切片，每張切片選取5個(gè)視野(×400)，且所選區(qū)域可以代表整張切片的陽(yáng)性程度，圖像分析系統(tǒng)掃瞄陽(yáng)性目標(biāo)1000個(gè)/視野以上，測(cè)定其陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值（MD）代表Cyr61的含量.1.2.2Cyr61mRNA檢測(cè)采用RT?PCR技術(shù)，以GAPDH為內(nèi)參照.取組織100mg勻漿后用Tripure提取液提取總RNA.取部分總RNA用17g/L
6、的瓊脂糖凝膠電泳檢查其提取效果，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm的A值，取A260/A280比值為1.8~2.0者用于RT反應(yīng).逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.Revertra逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，根據(jù)說明書加入組織總RNA1μL建立20μL反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增.Cyr61的上游引物:5′?ACTTCATGGTCCCAGTGCGC?3′，下游引物:5′?AAATCCGGGTTTCTTTCACA?3′，產(chǎn)物大小為106bp，GAPDH上游引物為:5′?CATCACCATCTTCCAGGAGCG?3′，下游引物:5′?TGACCTTGCCCACAGCCTTG?3
7、′產(chǎn)物大小為443bp.反應(yīng)體系25μL，包括：滅菌蒸餾水9.5μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，樣品cDNA1μL，上、下游引物各1μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，58℃45s,72℃45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸7mm.PCR產(chǎn)物在含有0.8μgEB的20g/L瓊脂糖凝膠中電泳，以QuantityOne定量分析系統(tǒng)對(duì)PCR條帶進(jìn)行分析，Cyr61在腫瘤組織和癌旁組織表達(dá)量以相應(yīng)GAPDH的表達(dá)量作為校正，以Cyr61與GAPDH相對(duì)光密度的比值為Cyr61在腫瘤組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量.統(tǒng)
8、計(jì)學(xué)處理:Cyr61表達(dá)量以x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間均值比較，采用t檢驗(yàn).P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
