川芎多糖除蛋白方法研究

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1、川芎多糖除蛋白方法研究作者：方升平，王維香，雒小龍【摘要】目的對川芎多糖進行除蛋白處理，篩選最佳除蛋白方法。方法采用Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3種方法對川芎多糖進行除蛋白處理，通過比較不同方法處理后的蛋白含量及多糖含量來確定最佳的除蛋白方法。結(jié)果Sevag法的蛋白質(zhì)去除率高(90%以上)，但多糖回收率僅為40%;三氯乙酸法的蛋白質(zhì)去除率為37.28%，多糖回收率為73.19%;三氯乙酸-正丁醇法的蛋白質(zhì)去除率為83.60%，多糖回收率為85.16%，且操作快速、簡便。結(jié)論三氯乙酸-正丁醇法除蛋白效果較好?！娟P(guān)鍵詞】川芎;多糖;除蛋白川芎為《中國藥典》2005年

2、版(I部)收載品種，為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，常用于治療月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕腹痛，胸脅刺痛，跌撲腫痛，頭痛，風(fēng)濕痹痛[1]。川芎含有內(nèi)酯類、生物堿類、酚類、以及揮發(fā)油類等多種化合物，對其多糖的研究也逐步受到重視[2,3]。鑒于多糖是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一，具有多種生理活性[4]，對川芎多糖的研究就顯得尤為必要。系統(tǒng)研究川芎中多糖物質(zhì)，闡明其生物活性，為開發(fā)高技術(shù)含量的川芎多糖保健食品和藥物提供理論基礎(chǔ)。其中，川芎多糖分離純化是首要和關(guān)鍵的步驟，多糖純度的高低直接影響后續(xù)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析、藥理活

3、性以及構(gòu)效關(guān)系研究的準(zhǔn)確性。在多糖提取液中[5～7]，蛋白質(zhì)卻占了很大的比例，因此，如何盡量多去除蛋白質(zhì)而保留多糖的有效成分是一個具有重要意義的課題。多糖中蛋白質(zhì)的去除方法有多種，包括Sevage法[8]、三氯乙酸法[8]、蛋白酶法[9]、鹽酸法[8]等。不同的方法適用不同來源的多糖，要具體摸索，實驗中常采用幾種方法聯(lián)合除蛋白。目前尚未見到去除川芎多糖中蛋白質(zhì)的研究報道，本實驗對川芎多糖粗提液中蛋白質(zhì)的去除方法進行了初步探討。1材料與儀器川芎購于成都中藥材市場，經(jīng)本學(xué)院制藥工程系唐燦博士鑒定為傘形科多年生草本植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根莖，

4、干燥粉碎，過40目篩，待用;葡萄糖、硫酸、蒽酮、三氯乙酸、正丁醇(均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)。UV-2600型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，電子天平BS200S(北京塞多利天平有限公司)。2方法2.1樣品制備稱取適量粉碎過篩的川芎粉末，經(jīng)石油醚索氏抽提脫脂后風(fēng)干，加入10倍蒸餾水，攪勻，100℃提取2h，離心取上清液，濾渣則以同樣條件重復(fù)提取2次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1∶10(1g川芎粉末∶10ml提取液)。2.2多糖測定方法采用蒽酮-硫酸法[5]工作

5、曲線方程為：Y=0.1652X-0.001(R2=0.9994)。Y：葡萄糖濃度(mg/ml);X：吸光度。2.3蛋白質(zhì)含量測定紫外吸收直接測定法[10]在紫外分光光度計上，以生理鹽水為對照，測得待測溶液在280nm和260nm兩種波長的吸光度(A280nm及A260nm)。將A280nm和A260nm波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質(zhì)的濃度。C=1.45A280nm-0.74A260nm式中C：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml);A280nm：溶液在280nm處測得的吸光度;A260nm：溶液在260nm處測得的吸光度。2.4除蛋白方法2.4.1Sevag法取25ml濃縮糖液，將氯

6、仿按濃縮液1/5體積加入，隨之再加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合物劇烈振蕩30min，分出水層和有機層交界處的變性蛋白質(zhì)。重復(fù)上述操作，直至無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)。測定上清液的多糖濃度和蛋白質(zhì)濃度。2.4.2三氯乙酸法取25ml濃縮糖液，加入適量的2mol/L三氯乙酸溶液，混合器上振蕩混合均勻后4℃下靜置過夜，離心棄去沉淀，收集上清液，測定多糖濃度和蛋白質(zhì)濃度。2.4.3三氯乙酸-正丁醇法取25ml濃縮糖液，加入適量的三氯乙酸與正丁醇的混合液于混和振蕩器上混合均勻，4℃下靜置一段時間，離心棄去沉淀，收集上清液，測定多糖濃度和蛋白質(zhì)濃度。3結(jié)果3.1Sevag法除蛋白效果重復(fù)Sevag

7、法操作11次，無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)(蛋白質(zhì)去除率在90%以上)，多糖回收率僅為40%。3.2三氯乙酸法除蛋白效果3.2.1三氯乙酸溶液的用量對除蛋白效果的影響由圖1可以看出，隨著三氯乙酸用量的增大，除蛋白效果增強，同時多糖的損失率也逐漸增加。但三氯乙酸的體積超過多糖液體積的7%時，多糖的損失加劇，而蛋白去除率增加緩慢。故三氯乙酸溶液合理用量為多糖體積的7%，此時蛋白去除率為26.28%，多糖回收率為65.79%。圖1三氯乙酸溶液的用量對多糖溶液中蛋白質(zhì)及多糖含量的影響3.2.2振蕩時間對除蛋白效