高效液相色譜法測定紫花高烏頭中烏頭堿的含量論文

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1、高效液相色譜法測定紫花高烏頭中烏頭堿的含量論文常福厚,韓瑞蘭,齊君,范蕾,王敏杰,尹琴【摘要】目的測定紫花高烏頭中烏頭堿的含量，為蒙藥紫花高烏頭中烏頭堿的含量提供檢測方法，制定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。方法采用高效液相色譜法，Kromasil(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，甲醇水三乙胺（71∶29∶0.1）為流動相，流速為1.0ml/min；檢測波長235nm。結(jié)果烏頭堿濃度在29.85～149.25μg/ml范圍之間與峰面積線性關(guān)系良好，r=0.9997。烏頭堿平均回收率為96.52%.freelexcelsumRrichb.的全草，蒙藥名為寶日-泵嘎

2、,收載于《中華醫(yī)學(xué)百科全書》（蒙醫(yī)分卷）《認(rèn)藥白晶鑒》《無誤蒙藥鑒》中，具有止咳、清肺之功效,主治流感、肺感、肺熱、瘟疫等作用［1］，其中烏頭堿既是其有效成分,也是其毒性成分?！吨袊幍洹罚?］采用比色法檢查烏頭堿的含量,而本研究建立了以高效液相色譜測定紫花高烏頭中烏頭堿含量的方法，以控制蒙藥材紫花高烏頭的質(zhì)量。1器材1.1儀器依利特UV-230+高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司):UV-230+紫外-可見檢測器、P230/P230p高壓恒流泵、EC2000色譜工作站。1.2材料紫花高烏頭采自內(nèi)蒙古赤峰市克什克騰旗大局子林場、赤峰市克什克騰旗

3、紅山子鄉(xiāng)、赤峰市寧城縣，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龐秀生教授鑒定為毛茛科植物紫花高烏頭AconitumexcelsumRrichb.的全草。方法學(xué)考察中均采用赤峰市克什克騰旗大局子林場所采集到的樣品。烏頭堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號110720-200308）；甲醇為色譜純，磷酸、鹽酸等試劑均為分析純，水為雙蒸水。2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱為Kromasil(250mm×4.6mm，5μm),流動相為甲醇水三乙胺（71∶29∶0.1）；流速為1.0ml/min；檢測波長235nm；進(jìn)樣量20μl。以此條件，烏頭堿能與其它成

4、分達(dá)到較好分離效果。結(jié)果見圖1～2。2.2對照品溶液的配制取烏頭堿對照品5.9mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，然后加甲醇至刻度，搖勻，即得（每毫升中含烏頭堿0.597mg）。2.3供試品溶液的制備取本品10g，過60目篩，精密稱定，加氨試液4ml，苯50ml，超聲30min，用酸水（2%鹽酸）萃取兩次，20ml/次，酸水調(diào)pH值為9，用氯仿萃取2次，20ml/次，合并氯仿液，低溫減壓揮干，殘渣用甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，搖勻，即得。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml對照品溶液分別置于10ml容量瓶中，加甲

5、醇至刻度，搖勻。分別吸取20μl注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo),對照品峰面積為縱坐標(biāo),.freell范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.5精密度實驗取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積并計算，結(jié)果烏頭堿的平均含量為0.0695mg/g，RSD為0.86%。圖1烏頭堿對照品HPLC圖譜（略）圖2紫花高烏頭HPLC圖譜（略）2.6穩(wěn)定性實驗取紫花高烏頭供試品溶液在0，1，2，3，4，5，6，9h分別進(jìn)樣20μl，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.43%，表明烏頭堿在9h內(nèi)保持穩(wěn)定。2.7重復(fù)性實驗取赤峰市克什克騰旗大局子林場供試品5份，各約1

6、g,精密稱定，分別按樣品提取方法提取、測定，結(jié)果烏頭堿品均含量為0.0671mg/g，RSD為1.78%。2.8加樣回收率實驗取赤峰市克什克騰旗大局子林場供試品5份，各約5g,精密稱定，分別加入烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.351mg/ml）1ml，按供試品溶液的方法處理并測定含量，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。烏頭堿平均回收率為96.52%，RSD為1.19%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確可靠。表1樣品中烏頭堿含量加樣回收實驗結(jié)果（略）2.9樣品含量測定取3個批次的樣品各兩份，每份約10g,精密稱定，按“2.3”項下操作，取20μl注入高效色譜儀，以色譜條件測定，計算烏

7、頭堿的含量。結(jié)果見表2。表2樣品含量測定結(jié)果（略）3討論中藥成分的提取多采用冷浸滲流法、煎煮法、有機(jī)溶劑加熱回流提取法，但提取的效果不盡相同。曾采用苯加氨試液浸泡，放置過夜的方法，對紫花高烏頭進(jìn)行提取，但效果不甚理想。本實驗采用在堿性條件下用苯超聲提取，提取液濾過后低溫減壓揮干。殘渣加甲醇溶解后進(jìn)行色譜分析的方法，本法與上述其它方法比較提取較完全，而且操作簡便。同時，采用超聲提取即防止成分遇熱易分解，又大大提高了提取效率。有作者曾對紫花高烏頭根中的二萜生物堿進(jìn)行了提取與鑒定［3,4］，而采用高效液相色譜法對紫花高烏頭中的烏頭堿進(jìn)行測定，尚未見報道。本研

8、究同時建立了蒙藥材紫花高烏頭的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。實驗結(jié)果顯示，采用高效液相色譜法測定烏頭堿的含量，