甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用

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1、甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用張建軍　李洪源　王吉錫　李鑫　樸英愛　陳振華　謝志平　楊慶偉【摘要】目的研究甘草抗病毒活性成分(GX)體外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法采用中性紅實(shí)驗(yàn)和觀察細(xì)胞病變(CPE)法，以利巴韋林為陽(yáng)性藥,測(cè)定GX對(duì)RSV的抑制作用。結(jié)果GX的半數(shù)中毒濃度（TC50）為460.00?μg/ml，半數(shù)有效抑制濃度(EC50)為23.53?μg/ml，治療指數(shù)(TI)為19.55;GX在RSV感染Hela細(xì)胞2，4，6，8，10?h后給藥,對(duì)RSV復(fù)制均有明顯的抑制作用(P0.01)；且GX對(duì)RSV有中和作用。結(jié)論　GX在體外對(duì)RSV復(fù)制

2、有明顯的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用　　呼吸道合胞病毒（RSV）是一個(gè)世界范圍內(nèi)嬰幼兒最常見的呼吸道感染的病原體。目前，對(duì)RSV的防治仍無(wú)有效的疫苗和藥物〔1〕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)抗病毒中藥的研究日益增多，從中篩選其有效成分已成為當(dāng)前抗病毒新藥開發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)〔2〕。本課題組在2004年報(bào)道甘草水提液具有明顯的抗RSV的作用；在2005年發(fā)現(xiàn)甘草有效部位GC314具有抗RSV的作用基礎(chǔ)上〔3〕,進(jìn)一步分離到抗病毒活性成分（GX），并在細(xì)胞水平上檢測(cè)其抗RSV的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。　　1對(duì)象與方法　　11材料　　甘草(產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)黑龍

3、江省藥品檢驗(yàn)中藥研究所鑒定)。利巴韋林注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司,批號(hào)：0610152)。人宮頸癌傳代細(xì)胞(Hela),(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒研究所)。呼吸道合胞病毒(RSV-Long株)(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒研究所)。RSV在Hela細(xì)胞中的組織半數(shù)感染量(TCID50)為1×10-6.6/0.2?ml。本次實(shí)驗(yàn)采用100TCID50/0.2?ml的感染量。硅膠制備板(安徽良臣硅源材料廠)。甲醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇等，均為分析純(天津市博迪化工有限公司)。中性紅(上海華舜生物工程有限公司)，用磷酸鹽緩沖液稀釋。脫色液：由無(wú)水乙醇、枸櫞酸鈉和鹽酸組

4、成?！　?2方法　　121甘草抗病毒活性成分（GX）的制備　　甘草經(jīng)水煎煮浸提、醇沉、大孔吸附樹脂柱層析得到的GC314,再經(jīng)由氯仿和甲醇組成的展開劑，在硅膠板上經(jīng)薄層層析得GX。　　122　藥物毒性實(shí)驗(yàn)　　用細(xì)胞維持液將GX和利巴韋林釋為7個(gè)濃度組，分別加入到Hela細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔培養(yǎng)板上。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置35℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3?d后，棄去維持液,每孔添加0.2?ml中性紅染液,放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)2?h。取出后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,添加0.2?ml脫色液。室溫暗處放置30?min后,酶標(biāo)儀450?nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)

5、值〔4〕，測(cè)定細(xì)胞存活率，求藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)。細(xì)胞存活率=藥物組平均A值/細(xì)胞對(duì)照組平均A值×100%?！　?23藥物抗RSV實(shí)驗(yàn)　　參照文獻(xiàn)〔5〕。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行。(1)藥物的抑制作用：在96孔板上，接種100TCID50/0.2?mlRSV液，0.2?ml/孔。吸附2?h后，分別加入不同濃度的GX和利巴韋林。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，待病毒對(duì)照組細(xì)胞病變(CPE)為4時(shí)，中性紅實(shí)驗(yàn)同上,測(cè)定病毒抑制率，求藥物的半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI)。病毒抑制率=〔實(shí)驗(yàn)組(藥物+病毒)平均A值-病毒對(duì)照組平均A值〕/〔正

6、常細(xì)胞對(duì)照組平均A值-病毒對(duì)照組平均A值〕×100%。CPE記錄規(guī)則：0為細(xì)胞無(wú)CPE；1為0～25%CPE；2為25%～50%CPE；3為50%～75%CPE；4為75%～100%CPE。TI=TC50/EC50。(2)不同時(shí)間給藥對(duì)RSV抑制作用：向96孔板中，加入100TCID50/0.2?mlRSV液，0.2?ml/孔，分別作用2，4，6，8，10，12?h后吸棄病毒液，再分別加入GX（濃度為120.00?μg/ml）和利巴韋林（濃度為80.00?μg/ml），培養(yǎng)方法同上。待病毒對(duì)照組CPE為4時(shí)，記錄CPE結(jié)果。(3)藥物的中和作用：200TCID50/

7、0.2?mlRSV液與含不同濃度藥物的維持液等體積混合，35℃作用2?h后,加到96孔板中，0.2?ml/孔。吸附2?h，棄上清，加細(xì)胞維持液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病毒對(duì)照組CPE為4時(shí)，記錄CPE結(jié)果?！　?3統(tǒng)計(jì)分析　　采用SAS?82軟件進(jìn)行分析。利用ReedMuench法測(cè)定病毒TCID50，Logit回歸計(jì)算藥物TC50和EC50〔6〕。不同時(shí)間處理組或不同劑量組與病毒對(duì)照組之間的結(jié)果比較采用Kruskal-Wallis法?！　?結(jié)果　　21藥物毒性結(jié)果測(cè)定　　根據(jù)中性紅實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率，Logit回歸計(jì)算得GX的TC50為460.00?μg/