成體小鼠腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定論文

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1、成體小鼠腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定論文【摘要】目的：利用簡(jiǎn)化無(wú)血清培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法，從成體小鼠腸管分離培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞(GNCSCs)，觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中增殖、分化的特點(diǎn).用p75,GFAP,Peripherin,αActin作為特異性標(biāo)志來(lái)鑒定GNCSCs及其分化的細(xì)胞系.方法：將新生1，5d的小鼠腸管制成單細(xì)胞懸液，接種于無(wú)血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察克隆球的形成過(guò)程.將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，觀察其分化現(xiàn)象.用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)克隆

2、球及其分化細(xì)胞系特異性標(biāo)志物的表達(dá).結(jié)果：成體小鼠腸管中有少數(shù)細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞.結(jié)論：成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)所必須的細(xì)胞類(lèi)型.【關(guān)鍵詞】腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞小鼠細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞分化Hirschsprung病0引言應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病.freelcells,GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療

3、先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注,本實(shí)驗(yàn)著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料新生1，5d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.①DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,vitrogen),β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）.②促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100mL/L肽牛血清.

4、③其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴(lài)氨酸（Sigma）.一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）.二抗為T(mén)RITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).1.2方法1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30min，10m

5、in，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過(guò)濾，以800r/min離心5min，棄上清，用預(yù)先配置的無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以6×108個(gè)/L接種到25mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4mL.在37℃,50mL/LCO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng).原代孵育24h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3d后進(jìn)行傳代，以6×108個(gè)/L接種到25mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.1.2.2

6、克隆球的分化用含100mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴(lài)氨酸蓋玻片的35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2mL，動(dòng)態(tài)觀察克隆球的分化情況.1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR,GFAP,Peripherin，αActin抗體分別檢測(cè)克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.2結(jié)果2.1克隆球的生長(zhǎng)狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán).孵育24h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小,折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增

7、大,.freel:developmentanddevelopmentaldisturbancespart2［J］.PediatrDevPathol,2002,5(4):329-349.［3］NatarajanD,GrigoriouM,MarcosGutierrezCV,etal.Multipotentialprogenitorsofthemammalianentericnervoussystemcapableofcolonizingaganglionicboent1999,126(1):157-168.［4］Bondu

8、randN,NatarajanD,ThaparN,etal.Neuronandgliageneratingprogenitorsofthemammalianentericnervoussystemisolatedfromfoetalandpostnatalgutcultures［J］.Developme