人tshr膜外區(qū)cdna克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

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1、人TSHR膜外區(qū)cDNA克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建【關(guān)鍵詞】人TSHR膜外區(qū)；RTPCR；真核表達(dá)載體在自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmunethyroiddisease,AITD)發(fā)病過程中，促甲狀腺激素受體(thyrotropinreceptor,TSHR)是重要的自身抗原[1]，機(jī)體產(chǎn)生針對TSHR的自身抗體(thyrotropinreceptorantibody,TRAb)是其主要的發(fā)病機(jī)制。由于存在于甲狀腺細(xì)胞膜上的TSHR數(shù)量少，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且難以純化，無法開展TSHR的進(jìn)一步研究。本文從人甲狀腺中提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得T

2、SHR膜外區(qū)cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體，建立了有效的TSHR體外表達(dá)系統(tǒng)。　　1材料與方法　　1.1組織和實驗材料　　甲狀腺組織于已確診的Graves手術(shù)患者。DH5α感受態(tài)細(xì)菌購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司，pMD18T克隆載體系日本TaKaRa公司產(chǎn)品，真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)系美國Invitrogen公司產(chǎn)品。RNAgentsTotalRNAIsolationSystem和AccesssRTPCRSystem為Promega公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取及凝膠回收試劑盒為上海博亞生物公司產(chǎn)品?！　?.2PCR引物的設(shè)計合成　　根據(jù)文獻(xiàn)

3、報告人促甲狀腺激素受體cDNA序列資料[2]，由上海華諾生物科技有限公司設(shè)計并合成一對用于擴(kuò)增hTSHR膜外區(qū)cDNA編碼區(qū)的寡核苷酸特異性引物：上游引物為5′ATTGGATCCAACATGGATATGAGGCCGGCGGACTTGCT3′，下游引物為5′GCCGAATCCCTACTTGTAGCCCATTATGTCTTCACAC3′。　　1.3總RNA的提取　　凍存的約100mg甲狀腺組織在盛有液氮的研缽中充分破碎，研磨成勻漿，按試劑盒說明逐步加入裂解液醋酸鈉、酚氯仿異丙醇，抽提組織中的總RNA，經(jīng)乙醇漂洗后溶于無RNA酶滅菌去離

4、子水。利用分光光度器測定RNA的A260和A280值。　　1.4RTPCR及產(chǎn)物的純化　　RNA樣品預(yù)處理于75℃變性5min后速放冰上冷卻。RTPCR反應(yīng)體系：AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5u/μL)1μL，TfiDNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/TfiBuffer10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA樣品加無RNA酶滅菌去離子水至50μL?；靹蚝笾肞CR儀上，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)為：48℃逆轉(zhuǎn)錄60min，94℃預(yù)變性2min。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45個循環(huán)后，68℃終延伸10m

5、in。對RTPCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法進(jìn)行純化濃縮。　　1.5克隆質(zhì)粒的構(gòu)建　　根據(jù)TA克隆原理[3]將TSHR膜外區(qū)片段插入pMD18T克隆載體。將TSHR膜外區(qū)(thyrotropinreceptorectodominant,ETSHR)片段3μL(約75ngDNA)，pMD18T克隆載體1μL(約50ngDNA)，T4DNA連接酶0.5μL，10×連接酶緩沖液5μL，加去離子水至10μL，至PCR儀上16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)菌，經(jīng)IGTP/Xgal平皿(Amp+)篩選，挑選單個白色菌落，放入10mLLB培養(yǎng)液中，37℃振搖

6、過夜。堿裂解法提取重組質(zhì)粒，雙酶切法篩選攜帶目的片段的陽性克隆子并純化?！　?.6真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定　　將上一步提純的pMDETSHR重組質(zhì)粒雙酶切后，定向插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。反應(yīng)體系為pMDETSHR重組質(zhì)粒5μL，10×KBuffer2μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。將酶切體系37℃過夜，65℃15min使滅活內(nèi)切酶。經(jīng)凝膠電泳后分離目的片段ETSHR，提純濃縮后加入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，再建立連接體系。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂于瓊脂平板(Amp+)，挑選陽性克隆，酶切電泳分析，

7、并送上海華諾生物科技公司鑒定。　　2.3真核表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果　　酶切電泳后，出現(xiàn)分子量約5420bp和1245bp的兩條特異性DNA片段，其中的小片段與PCR產(chǎn)物一致，表明獲得正確克隆(圖2)。　　2.4測序結(jié)果　　克隆片段為1245bp的ETSHR編碼區(qū)，與已發(fā)表的序列完全一致[2]，證實有包括起始密碼子和kozak序列的完整ETSHR正確插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中。　　3討論　　Nagayama于1989年利用G蛋白耦聯(lián)受體家族中各受體間具有相似的結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，首先分離出了完整的人TSHRcDNA克隆。主要存在于甲狀腺細(xì)胞

8、膜上的TSHR蛋白含量較少，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，建立TSHR體外表達(dá)系統(tǒng)成為解決問題的關(guān)鍵。原核重組蛋白缺乏正?？臻g結(jié)構(gòu)和糖基化，很快被真核表達(dá)系統(tǒng)所取代。TSHR體外表