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《MBP不同cDNA序列真核表達載體構(gòu)建及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、MBP不同cDNA序列真核表達載體構(gòu)建及鑒定［摘要］目的以pEGFP-N1質(zhì)粒載體為介導(dǎo)，構(gòu)建針對髓鞘堿性蛋白(MBP)不同isoformcDNA的表達載體。方法將三段不同MBPcDNA序列克隆入pEGFP-Nl質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，酶切鑒定及測序。結(jié)果測序結(jié)果顯示插入的三段目的片段的序列與理論序列一致。結(jié)論筆者成功構(gòu)建了pEGFP-N1-MBP21.5,pEGFP-Nl-MBP18.5和pEGFP-N1-MBP17.3三個重組真核表達載體，為進一步研究不同MBPcDNA在真核細胞中的表達情況
2、和功能差異奠定基礎(chǔ)。［關(guān)鍵詞］MBPcDNA；真核表達；pEGFP-Nl質(zhì)粒；載體構(gòu)建［中圖分類號］R-33［文獻標(biāo)識碼］A［文章編號］1674-4721(2012)12(c)-0005-03髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein,MBP)是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突細胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)雪旺細胞合成的一種膜蛋白，含有多種堿性氨基酸，為髓鞘的構(gòu)成蛋白。MBP對人腦發(fā)育、神經(jīng)細胞分化、髓鞘發(fā)生與髓鞘形成具有重要生理作用［llo1962年，LaatschRH等［2］首先從豚鼠腦中分離出MBP,隨后國
3、內(nèi)外學(xué)者在生理、生化及分子水平上對MBP進行了廣泛而深入的研究。人和鼠的MBP基因均位于第18號染色體遠端即18q22?23,跨度32?34Kb,含有7個外顯子。人腦中有21.5,20,18.5,17.3和14kDa等mRNA拼接產(chǎn)物，除21.5kDa外，其余缺失外顯子II、III或VI,成人髓鞘中18.5kDaMBP含量最高[3-7]o1材料與方法1.2.3連接及轉(zhuǎn)化線性載體與目的片段序列用T4DNAligase,4￡連接過夜，CaC12法制備轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5a,涂布于卡那抗性LB平板
4、，37匸恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。1.2.4質(zhì)粒篩選及鑒定挑選克隆，提取質(zhì)粒（按TaKaRa公司說明書），HindHI和SalI雙酶切鑒定挑選陽性重組子，上海生工公司測序。2結(jié)果2.1MBPcDNAPCR擴增結(jié)果2.3質(zhì)粒測序結(jié)果3討論3種MBPcDNA的表達在不同組織細胞和發(fā)育階段中，具有較大差異?，F(xiàn)階段我們對不同MBP蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和分化過程中的具體作用和功能差異還缺乏了解。筆者將3個不同長度MBPcDNA片段插入攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的pEGFP-Nl真核表達質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構(gòu)
5、建pEGFP-Nl-MBP21.5、pEGFP-Nl-MBP18.5和pEGFP-Nl-MBP17.3三個質(zhì)粒載體，為進一步研究不同MBPcDNA在真核細胞中的表達情況和作用機制奠定了基礎(chǔ)。[參考文獻][1]RumsbyMG.Organizationandstruetureincentral-nervemyelin[J]?BiochemSoeTrans,1978,6(2)：448-462._2]LaatschRH,Thomson,JChem,etal.Theencephalomyeliticactiv
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