大蒜硫化物調(diào)控線粒體呼吸簡述

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1、大蒜硫化物調(diào)控線粒體呼吸簡述-->第1章緒論1.1前言線粒體呼吸失調(diào)同一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2],例如位居各種心臟病發(fā)病首位的急性心肌缺血。在急性心肌缺血發(fā)生時,線粒體氧利用、線粒體質(zhì)子滲透和線粒體呼吸[3]發(fā)生變化,內(nèi)源性ATP依賴性鉀通道(KATP)關(guān)閉[4],血管平滑肌異常收縮,心肌供血不足或斷流。當(dāng)線粒體呼吸異常成為發(fā)病因素時,調(diào)節(jié)線粒體呼吸成為解決急性心肌缺血的有效方法,探索發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)劑成為治療急性心肌缺血的重要藥物候選。大蒜硫化物[5-7]對線粒體呼吸具有一定的調(diào)控作用,可能成為有希望的

2、治療急性心肌缺血候選藥物。不同大蒜硫化物對線粒體呼吸的影響與心肌線粒體微環(huán)境pH值、代謝產(chǎn)物種類、濃度和時間相關(guān)[1,8]。由于硫化氫(Hydrogensulfide,H2S)能夠舒張異常收縮血管平滑肌,具有抗急性心肌缺血效應(yīng),引發(fā)了研究者對H2S作用于急性心肌缺血調(diào)控機(jī)制的濃烈興趣[4,9-10]。而H2S氣體直接使用存在毒性不易控制[11-12]和人們心里難以接受等問題[13-15],直接應(yīng)用受到阻礙,尋找安全、穩(wěn)定和可控的H2S成為解決這一問題的突破口。大蒜具有濃烈的刺激氣味,含有多種脂溶性和水溶

3、性硫化物,在血管內(nèi)經(jīng)紅細(xì)胞膜內(nèi)外巰基交換[8]和脫氧血紅蛋白半胱氨酸殘基修飾[16]可以生成H2S,為研究大蒜-大蒜硫化物-H2S-線粒體呼吸調(diào)控-KATP開放-舒張異常收縮血管平滑肌-急性心肌缺血恢復(fù)的機(jī)制[17]奠定了基礎(chǔ)。........1.2線粒體呼吸的研究進(jìn)展1.2.1線粒體呼吸鏈結(jié)構(gòu)1857年,阿爾伯特•馮•科立克在肌肉組織細(xì)胞中觀察到顆粒狀物質(zhì)。1898年,德國科學(xué)家卡爾•本達(dá),借用希臘語“線mitos”和“顆粒chondros”組成“mitochond

4、rion”。線粒體屬于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大膜性細(xì)胞器,多數(shù)直徑為0.5-1.0μm,長軸1.5-3.0μm,通過光學(xué)顯微鏡可以觀察到較小顆粒狀形態(tài)結(jié)構(gòu)。不同種類生物體或同一種類生物體不同類型組織線粒體數(shù)量差異較大,肝臟細(xì)胞含有1000-2000個線粒體,酵母菌細(xì)胞含有大型分支線粒體,哺乳動物成熟紅細(xì)胞不含有線粒體。研究表明:細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量決定細(xì)胞代謝水平,線粒體越多代謝越旺盛。線粒體形狀易變,可以呈啞鈴型、環(huán)形、線狀、顆粒狀和枝裝,大小不一,不均勻分布,鼠神經(jīng)元線粒體和兔心線粒體透射電鏡結(jié)構(gòu),見圖1.1A和B

5、。線粒體直接參與三大物質(zhì)代謝、電子傳遞、質(zhì)子轉(zhuǎn)移和ATP形成等人體生命基本活動過程。首先,參加三大物質(zhì)代謝。蛋白質(zhì)、脂肪和糖代謝的共同代謝產(chǎn)物乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)[19-20]。20種人體氨基酸代謝為丙酮酸、乙酰CoA或三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物,線粒體基質(zhì)是三羧酸循環(huán)細(xì)胞內(nèi)分解代謝的主要部位,線粒體是大多數(shù)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換和輸出的中樞[21]。細(xì)胞基質(zhì)糖酵解生成的丙酮酸和NADH[22-23],在缺氧時,丙酮酸被NADH還原成乳酸,反應(yīng)生成NAD+被糖酵解重新利用;在有氧時,丙酮酸在膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助下,進(jìn)入線粒

6、體基質(zhì),在丙酮酸脫氫酶系催化下氧化脫羧,生成乙酰CoA[24],同時,NAD+還原成NADH。........第2章線粒體的制備2.1實(shí)驗(yàn)材料線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的膜性細(xì)胞器,在急性心肌缺血發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,特別體現(xiàn)為線粒體呼吸的變化。研究大蒜提取液、有機(jī)硫化物、元素硫和H2S對線粒體呼吸的影響,需要制備符合實(shí)驗(yàn)要求的線粒體。線粒體基本結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)有線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)四個重要功能部位。線粒體外膜對氧化的物質(zhì)初步分解,由于線粒體外膜有孔蛋白較高通透性和線粒體內(nèi)膜較低通透

7、性,線粒體膜間隙內(nèi)容物組成與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)接近,含有大量反應(yīng)底物、可溶性酶和輔助因子。線粒體內(nèi)膜含有很多蛋白質(zhì),參與氧化磷酸化和ATP合成,線粒體嵴上有線粒體基粒,基粒中有ATP合酶,利用呼吸鏈產(chǎn)生的能量合成ATP。線粒體基質(zhì)是線粒體內(nèi)膜包裹的內(nèi)部空間,參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸降解等反應(yīng)。研究化學(xué)物質(zhì)對線粒體呼吸的影響,不但需要提供線粒體,而且要保證分離提取的線粒體結(jié)構(gòu)盡可能完整,機(jī)械損害降到最低限度,滿足實(shí)驗(yàn)需要。以甘油為例,線粒體提取液加10%(V/V)甘油,可以有效避免周圍環(huán)境溫度變化對蛋白

8、質(zhì)活力的不利影響[119],因此,線粒體制備過程中,保持線粒體完整性十分重要,根據(jù)Rasmussen[120-121]和Bottje[122]方法,結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件,適當(dāng)調(diào)整分離提取方法,獲得了符合實(shí)驗(yàn)要求的線粒體。.......2.2線粒體分離提取和鑒定2.2.1線粒體分離提取密度梯度法分離提取牛心線粒體,程序如下:在0-4℃低溫冷凍室內(nèi),實(shí)驗(yàn)采用500g新鮮牛心,剪去脂肪和結(jié)締組織,切成小塊,組織攪碎機(jī)攪碎4次,放入燒杯中,按質(zhì)量和體積