rsistin基因的克隆及載體的構建

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1、rsistin基因的克隆及載體的構建【摘要】目的：克隆小鼠resistin基因及其連載體的構建，為進一步研究resistin的功能打下基礎。方法：根據報道的小鼠resistin基因的全長mRNA序列為目的基因，即提取小鼠脂肪組織中的RNA，以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，逆轉錄（RT）合成resistinDNA，再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶鏈反應（PCR）擴增resistincDNA，將擴增PCR產物（resistincDNA）經純化后與AT連接于pGEMT載體，重組質粒轉化JM109感受態(tài)菌，藍白斑篩選陽性菌落，搖菌、提取質粒。結果：提取的總RNA純

2、度A260/280為1.9,電泳條帶28s∶18s比例約為2∶1,RTPCR與欲擴增的目的片段的理論長度363bp相符,重組質粒插入pGEMT的DNA片段的核苷酸序列與小鼠resistin基因mRNA編碼區(qū)序列完全一致。結論：成功克隆了小鼠resistincDNA基因，為構建resistin基因打下基礎?！娟P鍵詞】小鼠resistin基因；載體；構建　　resisin又稱抵抗素，可損害糖代謝，影響組織對胰島素的敏感性［1］，被認為可能是聯系肥胖與Ⅱ型糖尿病的重要紐帶［2,3］。小鼠resistin基因mRNA全長519個堿基,編碼區(qū)(cds)是由84位至428位共

3、345個堿基組成,編碼114個氨基酸殘基組成的resistin蛋白質。目前對resistin的生物功能了解甚少，為了探討resistin的功能，本研究擬用RTPGR技術從小鼠脂肪組織中擴增resistincDNA，A/T克隆于pGEMT載體。為進一步研究resistin功能及與糖尿病的關系奠定實驗基礎?！　?材料與方法　　1.1主要試劑TRIolReagent總RNA提取和THERMOSCRIPTTMRTPCRSystem（購自GIBCOLBRL公司），PCG引物（由TakaRaBiotech公司合成）QiaquickGelExtractionKit、Plasm

4、idQiaprepSpinMiinprepKit和EndofreePlasmidMaxiKit（購自QIAGEN公司），pGEMTvectorsystemI（購自promega公司），限制性內切酶XbaI、EcoRI和NotI(購自ENB或MBIFermenta或Rroche公司),T4DNA連接酶(購自TakaraBiotech公司)，JM109大腸桿菌由本院醫(yī)學研究中心提供。　　1.2方法　　1.2.1總RNA測定提取總RNA：取正常雄性BALB/C小鼠，16周齡，體重38g（購自中山大學動物實驗中心）。取其脂肪200mg，按照一步法提取總RNA。檢測總RNA：

5、電泳檢測總RNA質量；紫外分光光度法檢測總RNA純度和含量。RNA濃度計算：RNA=A260×40×稀釋倍數?！　?.2.2逆轉錄合成cDNA按MmnlvRTPCR試劑盒說明書操作逆轉錄合成cDNA?！　?.2.3PCR擴增resistincDNAPCR引物設計,根據小鼠resistin基因mRNA序列,用計算機軟件設計引物,并在上、下游引物的5’端分別引入EcoR1和XbaⅠ酶切位點。上游引物：5'CGGAATTCATGAACCTTTCATTTCC3'（下劃線的部分為EcoR1酶切位點）；下游引物：5'CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAG

6、CT3'（下劃線的部分為XbaⅠ酶切位點）；擴增resistin基因全長編碼區(qū)序列,擴增片段理論長度為363bp。在一個50μl的反應體系中進行PCR，并對反應體系中RT產物、引物和MgCl2的量及熱循環(huán)參數進行了數次優(yōu)化，共同進行了35循環(huán)。2%的瓊脂糖凝膠電泳成像?！　?.2.4凝膠回收純化PCR產物按QiaquickGelExtractionKit操作說明，凝膠電泳觀察回收結果,紫外分光光度法檢測DNA含量及純度檢測?！　?.2.5受體感受態(tài)JM109菌的制備用CaCl2法(0.1M的進口CaCl2)制備感受態(tài)細胞?！　?.2.6純化PCR產物AT連接于pG

7、EMT載體按插入片段與載體的摩爾比為3∶1的量進行連接反應,總反應體系10μl,置4℃冰箱過夜連接?！　?.2.7連接反應液轉化JM109感受態(tài)菌液連接DNA反應液10μl,加入200μl受體感受態(tài)菌液中，最后行藍白斑篩選，挑選單個白色菌落，加入2μlLB液體培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素），37℃震蕩增殖轉化菌?！　?.2.8提取重組質粒PGEMTrEisitin上述菌液擴增至生長晚期，按QiaprepSpinMiniprepKit操作說明提取質粒。凝膠電泳提取的重組質粒的質量和紫外分光光度法檢測DNA含量及純度檢測?！　?.2.9鑒定和保存重組質粒