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《花生cem1基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、轉(zhuǎn)自發(fā)表吧論文范文發(fā)表論文發(fā)表花生CEM1基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建作者:張廷婷等摘要：通過(guò)規(guī)模測(cè)序和生物信息學(xué)分析，從花生莢果不同發(fā)育時(shí)期全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中篩選出MADS-box家族的一個(gè)cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CEM1基因（GenBank登錄號(hào)為EY396043）。該基因全長(zhǎng)1061bp，包含762bp的開(kāi)放閱讀框，編碼253個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為29405ku，等電點(diǎn)（pI）為918。蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析和疏水性分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)信號(hào)肽剪切的可能性很小，具有親水性。同時(shí)構(gòu)建CEM1基因的VI
2、GS表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：花生；莢果發(fā)育；CEM1基因；生物信息學(xué)；載體構(gòu)建 中圖分類(lèi)號(hào)：Q785：S565.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）08-0009-06 MADS-box的名稱(chēng)來(lái)自釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子MCM1、擬南芥花同源異型基因蛋白AGAMOUS、金魚(yú)草花同源異型基因蛋白DEFICIENS和人血清應(yīng)答因子SRF4種蛋白的首字母，這4種蛋白質(zhì)都有一個(gè)由56～58個(gè)氨基酸組成的高度保守的MADS盒，編碼含有這種保守序列蛋白因子的基因稱(chēng)為M
3、ADS-box基因。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-inducedgenesilencing，VIGS）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可以引起內(nèi)源mRNA序列特異性降解[1，2]，即如果在病毒載體中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物會(huì)表現(xiàn)出目的基因功能喪失或者表達(dá)水平下降的表型，從而確定基因功能。其作用機(jī)制為：含有目的基因片段的病毒載體在被侵染的植物組織中大量復(fù)制，病毒載體中的目的片段在RNA引導(dǎo)的RNA聚合酶作用下合成大量的雙鏈RNA（Double-strandedRNA，dsRNA）；ds
4、RNA在Dicer酶的作用下產(chǎn)生21～25個(gè)核苷酸的短干擾RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）；然后，siRNA的反義鏈和RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）結(jié)合，特異性識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中目的基因的單鏈mRNA，造成目的基因mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致目的基因在RNA水平上的沉默[3～5]。本試驗(yàn)克隆了花生MADS-box基因，對(duì)其及編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了VIGS表達(dá)載體，為轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)，這對(duì)花生分子育種實(shí)踐以
5、及闡明果實(shí)與種子發(fā)育相關(guān)的遺傳和生理現(xiàn)象具有重要意義。 1材料與方法11試驗(yàn)材料 1.1.1植物材料本研究所用材料為花生品種閩花6號(hào)?！ ?.1.2試劑與儀器本研究所用逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、ExTaq酶、RNA酶抑制劑、內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等購(gòu)自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。 Biometra轉(zhuǎn)自發(fā)表吧論文范文發(fā)表論文發(fā)表PCR儀購(gòu)自華粵行儀器有限公司；U
6、V-2800/2802/2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自尤尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2000系列紫外分析儀購(gòu)自天能科技（上海）有限公司?！ ?結(jié)果與分析 2.1花生CEM1基因的克隆 通過(guò)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)篩選和EST測(cè)序得到了該基因的EST序列，其克隆號(hào)為2P7，命名為CEM1，GenBank登錄號(hào)為EY396043。雙向測(cè)序結(jié)果表明CEM1全長(zhǎng)1061bp，包含一個(gè)762bp的ORF，編碼253個(gè)氨基酸（圖1），相對(duì)分子量為29405ku，理論等電點(diǎn)（pI）為918。將該基因序列在NCBI中
7、進(jìn)行Blast比較，結(jié)果與豌豆已知基因（GenBank登陸號(hào)為AAX69070）的同源性為79%；將推導(dǎo)的氨基酸序列在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行Blast分析，結(jié)果與一個(gè)花生MADS-box基因氨基酸序列同源性為84%，由此確認(rèn)CEM1是花生MADS-box基因。 2.2CEM1蛋白序列分析 將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列與其它10個(gè)物種來(lái)源的MADS-box氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。序列比對(duì)結(jié)果顯示CEM1與大豆的AGL1（GI：358248235）序列比較一致，與苜蓿等其它來(lái)源的氨基酸序列也存在一定的
8、同源性（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示CEM1與大豆AGL1親緣關(guān)系較近（圖3）?！ ?.3CEM1蛋白的結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽與疏水性分析 將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)該序列有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：MADS_MEF2_like功能域和K-box結(jié)構(gòu)域（圖4）。具有MADS-box蛋白的典型結(jié)構(gòu)。 3討論 MADS-box是一類(lèi)數(shù)量龐大的基因家族，其編碼的蛋白是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的MADS-box結(jié)構(gòu)域和半保守
