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1、小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定作者：田蓉，李巍，于繼云，劉玉峰【關(guān)鍵詞】樹(shù)突細(xì)胞 Invitrocultureandcharacterizationofmousespleendendriticcells 【Abstract】AIM:Toexploreandoptimizethemethodsforinvitrocultureofmousedendriticcells(DC)thatorphologicallyandidentifiedbiologically.METHODS:Miceg/kgcyclophosphamidethroughthet
2、ailvEin,andethodsfirstly,and3dlaterconditionalmediumcontainingIL4,GMCSFicroscope,scanningelectronmicroscope,andtransmissionelectronmicroscopeanalysis.Atday3,5,7,cellsarkers.RESULTS:CulturedcellsdisplayedatypicalDCphenotypeinmorphologicalanalysis,andFACSshoarkersasCD11c,CD86,ⅠA
3、b,H2D6.CONCLUSION:UsingofIL4,GMCSF,TNFαasstimulatorsinthemousespleencellculturecanobtainDCakesafoundationforfutureresearchonthebasicandclinicalusageofDC. 【Keyolecule 【摘要】目的：探索、優(yōu)化體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的方法，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)鑒定.方法：應(yīng)用環(huán)磷酰胺200mg/kg經(jīng)尾靜脈注射Balb/c小鼠，8d后處死小鼠，常規(guī)培養(yǎng)脾細(xì)胞，第3日加入含有IL4,G
4、MCSF細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)液，第5日補(bǔ)加TNFα,第8日制備標(biāo)本進(jìn)行相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察，并分別在培養(yǎng)第3,5,7日經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)成熟細(xì)胞表面標(biāo)志.結(jié)果：刺激培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察，具有典型的DC形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面表達(dá)CD11c,CD86,ⅠAb,H2D6標(biāo)志物.結(jié)論：在小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)中加入IL4,GMCSF,TNFα等刺激，可獲得足量、較高純度的DC，為DC的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】樹(shù)突細(xì)胞；細(xì)胞因子；MHCⅡ類(lèi)分子 0引言 自從StEInman等于1973年發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀
5、細(xì)胞（dentriticcell,DC）以來(lái)［1］，DC作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，其強(qiáng)大的提呈抗原作用和啟動(dòng)初始T細(xì)胞的能力，日益引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注.特別是DC與腫瘤免疫的密切關(guān)系以及在抗腫瘤方面的獨(dú)特功能，使其成為腫瘤免疫研究的一個(gè)重要領(lǐng)域.DC來(lái)源于骨髓CD34+細(xì)胞［2］，獲得一定量有功能的DC是深入研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，然而DC在體內(nèi)分布散在，含量極低，在動(dòng)物和人外周血中尚不足白細(xì)胞總量的1%.目前體外培養(yǎng)DC的方法尚不盡人意，在很大程度上限制了對(duì)DC基礎(chǔ)和臨床工作的開(kāi)展.我們?cè)隗w外培養(yǎng)擴(kuò)增了Balb/c小鼠的DC細(xì)胞，在培養(yǎng)中添加
6、IL4,GMCSF,TNF等刺激，并通過(guò)相差顯微鏡、電鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為優(yōu)化DC的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行積極的探索. 1材料和方法 1.1材料環(huán)磷酰胺購(gòu)自上海華聯(lián)公司；熒光標(biāo)記抗體：CD11cFITC,IAbFITC,H2DbFITC,CD86FITC購(gòu)自Diaclone公司；rmGMCSF,rmIL4,TNFγ，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCOL公司；Hepes，青霉素，鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)，低速離心機(jī)為北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)，微量臺(tái)式高速離心機(jī)為
7、德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為Coulter公司生產(chǎn)，掃描電鏡、透射電鏡由美國(guó)BD公司生產(chǎn)；6~8g/kg體質(zhì)量由小鼠尾靜脈注射，8d后頸椎脫位處死小鼠，750mL/L乙醇浸泡10min，無(wú)菌條件下用鑷子取出脾臟移入放在平皿的100鉬鋼網(wǎng)上，剔除脾周?chē)慕Y(jié)締組織，剪碎、研磨后收集濾過(guò)的細(xì)胞懸液，離心800r/min,7min，加TrisNH4Cl3mL，溶除紅細(xì)胞，獲取細(xì)胞懸液，以完全培養(yǎng)基懸浮為1×109/L細(xì)胞，37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng).3d后，吸棄全部培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，加rmGMCSF/rmIL4條件培養(yǎng)基隔日半量換液，第
8、5d補(bǔ)加細(xì)胞因子TNFγ1mg/L，第7d吹打下疏松貼壁的增殖性細(xì)胞聚集體，次日收集懸浮的細(xì)胞即為富集的DC.相差顯微鏡下
