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《小鼠樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、小鼠樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定論文田蓉，李巍，于繼云，劉玉峰【關(guān)鍵詞】樹突細(xì)胞Invitrocultureandcharacterizationofmousespleendendriticcells【Abstract】AIM:Toexploreandoptimizethemethodsforinvitrocultureofmousedendriticcells(DC)thatorphologicallyandidentifiedbiologically.METHODS:Miceg/kgcyclophosphamidethroug
2、hthetailvein,andethodsfirstly,and3dlaterconditionalmediumcontainingIL4,GMCSFicroscope,scanningelectronmicroscope,andtransmissionelectronmicroscopeanalysis.Atday3,5,7,cellsarkers.RESULTS:CulturedcellsdisplayedatypicalDCphenotypeinmorphologicalanalysis,andFACSshoarkers
3、asCD11c,CD86,.freelulatorsinthemousespleencellculturecanobtainDCakesafoundationforfutureresearchonthebasicandclinicalusageofDC.【Keyolecule【摘要】目的：探索、優(yōu)化體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增小鼠樹突狀細(xì)胞（DC）的方法，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)鑒定.方法：應(yīng)用環(huán)磷酰胺200mg/kg經(jīng)尾靜脈注射Balb/c小鼠，8d后處死小鼠，常規(guī)培養(yǎng)脾細(xì)胞，第3日加入含有IL4,GMCSF細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)液.freel
4、an等于1973年發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞（dentriticcell,DC）以來［1］，DC作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，其強(qiáng)大的提呈抗原作用和啟動初始T細(xì)胞的能力，日益引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注.特別是DC與腫瘤免疫的密切關(guān)系以及在抗腫瘤方面的獨(dú)特功能，使其成為腫瘤免疫研究的一個重要領(lǐng)域.DC來源于骨髓CD34+細(xì)胞［2］，獲得一定量有功能的DC是深入研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，然而DC在體內(nèi)分布散在，含量極低，在動物和人外周血中尚不足白細(xì)胞總量的1%.目前體外培養(yǎng)DC的方法尚不盡人意，在很大程度上限制了對DC基礎(chǔ)和臨床工作的開展.我們在體外培
5、養(yǎng)擴(kuò)增了Balb/c小鼠的DC細(xì)胞，在培養(yǎng)中添加IL4,GMCSF,TNF等刺激，并通過相差顯微鏡、電鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測分析對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為優(yōu)化DC的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行積極的探索.1材料和方法1.1材料環(huán)磷酰胺購自上海華聯(lián)公司；熒光標(biāo)記抗體：CD11cFITC,IAbFITC,H2DbFITC,CD86FITC購自Diaclone公司；rmGMCSF,rmIL4,TNFγ，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶購自美國GIBCOL公司；Hepes，青霉素，鏈霉素購自美國Sigma公司；倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司
6、生產(chǎn)，低速離心機(jī)為北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)，微量臺式高速離心機(jī)為德國Heraeus公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為Coulter公司生產(chǎn)，掃描電鏡、透射電鏡由美國BD公司生產(chǎn)；6~8g/kg體質(zhì)量由小鼠尾靜脈注射，8d后頸椎脫位處死小鼠，750mL/L乙醇浸泡10min，無菌條件下用鑷子取出脾臟移入放在平皿的100鉬鋼網(wǎng)上，剔除脾周圍的結(jié)締組織，剪碎、研磨后收集濾過的細(xì)胞懸液，離心800r/min,7min，加TrisNH4Cl3mL，溶除紅細(xì)胞，獲取細(xì)胞懸液，以完全培養(yǎng)基懸浮為1×109/L細(xì)胞，37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng).3d后，
7、吸棄全部培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，加rmGMCSF/rmIL4條件培養(yǎng)基隔日半量換液，第5d補(bǔ)加細(xì)胞因子TNFγ1mg/L，第7d吹打下疏松貼壁的增殖性細(xì)胞聚集體，次日收集懸浮的細(xì)胞即為富集的DC.相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn).1.2.2掃描電鏡觀察取如上培養(yǎng)7d的細(xì)胞懸液，接種放置在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng).待細(xì)胞匯合，取出蓋片，浸入PBS漂洗細(xì)胞表面；將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的40mL/L戊二醛，在4℃固定2h，吸出固定劑，PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預(yù)冷的10g/L鋨酸固定，
8、在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min；用系列梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，掃描電鏡觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu).1.2.3透射電鏡觀察取如上培養(yǎng)7d的細(xì)胞懸液，PBS洗滌，細(xì)胞沉淀用40mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脫水，包埋，經(jīng)超薄切片鉛鈾
