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1、實(shí)驗(yàn)九偽狂犬病毒PCR診斷實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟；2、掌握偽狂犬病毒PCR檢測的方法；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、講述PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟，讓同學(xué)們觀看PCR反應(yīng)的動(dòng)畫；2、偽狂犬病毒PCR檢測。什么是PCR？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)）發(fā)明了PCR。1985關(guān)于PCR的文章首
2、次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn)。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第
3、一個(gè)“年度分子”。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1992年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專利；KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測1999年西方發(fā)達(dá)國家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查PCR原理PCR是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA
4、變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)（25?30次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴(kuò)增。（1）DNA模板的熱變性將待擴(kuò)增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應(yīng)體系中作為
5、模板。（2）模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。（3）引物延伸將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。以上為1次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸）（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）按照上述（變性、復(fù)性和延伸）3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。模板DNA擴(kuò)增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimere
6、xtensionPCRproduct標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ul2.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102?105個(gè)拷貝；RNA作為模板時(shí)，需要：RNA-------cDNA-------PCR,稱此為RT-PCR.（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是從耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃
7、穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。逆轉(zhuǎn)錄酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)的原則（一）①引物長度：15-30bp，常用
8、為20bp左右引物的有效長度不能大于38bpmer，否則最適延伸溫度會(huì)超過Taq
