石斛屬植物rbcl基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育初步研究

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1、石斛屬植物rbcL基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育初步研究【摘要】目的探討10種石斛植物葉綠體rbcL基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。方法根據(jù)Genebank已經(jīng)公布的植物rbcL基因序列設計一對引物，用于石斛rbcL基因PCR擴增?；蛐蛄信帕杏肅lustalX軟件完成，應用Seqnconverter軟件分析序列的長度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）獲得最大簡約系統(tǒng)樹；應用自展法（bootstrap）檢驗系統(tǒng)樹，自展次數(shù)為1000次。結(jié)果10種石斛植物葉綠體rbcL基因的長度范圍為9

2、44～950bp，其中536bp為保守位點，466bp為變異位點，439bp為具有系統(tǒng)發(fā)育信息的信息位點?；蛑蠫C含量為40.61%～41.37%，GpC含量為4.03%～4.78%，GCskeplants.MethodsApairofprimersplifytherbcLgene.Genesequence,thecontentsofG+C,thecontentsofGpC,thevalueofGCskeaximum-parsimony(MP)method.Bootstrapanalysisplingsofthe

3、dataset.Results944～950bpnucleotidesDendrobiumplants.Conservedsites,variablesitesandphylogeicallyinformativesitesphylogeny.　　Key;rbcLgene;Sequenceanalysis;Phylogeny　　石斛是我國傳統(tǒng)貴重中藥材，現(xiàn)代藥理研究證明其具有增強免疫、抗腫瘤、抗衰老、治療白內(nèi)障等作用〔1〕。由于石斛屬植物集藥用和觀賞于一體，被過度地開發(fā)利用，加上生境的破壞及自身生長緩慢等原因，石斛

4、野生資源瀕于絕滅。迄今為止，石斛屬植物的研究已在形態(tài)學、比較解剖、植物化學、同工酶和等位酶等方面積累了許多資料〔2，3〕。運用PCR和DNA測序等方法，從分子系統(tǒng)學角度對石斛進行研究也有一些報道，所選擇的基因包括matK基因〔4〕和rRNA基因〔5〕。l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一種具有羧化和加氧雙重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起著重要作用。Rubisco酶由15個亞基組成，包括8個大亞基和8個小亞基。其中大亞基基因（rbcL）由葉綠體基因組編碼，小亞基基因（rbcS）由核基因組編碼，

5、其中rbcL基因已經(jīng)成為分子系統(tǒng)學研究中使用最為廣泛的分子指標之一。為此，本文嘗試對10種石斛植物rbcL基因進行測序并分析，旨在為研究石斛植物的系統(tǒng)發(fā)育提供核苷酸序列方面的證據(jù)?！　?材料實驗所用石斛植物采自云南的原始森林，現(xiàn)被整叢栽種于山東理工大學生命科學學院植物組織培養(yǎng)實驗室以便及時取材和觀察。見表1?！　?方法　　2.1總DNA的提取　　取各樣品新鮮原植物的葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA〔6〕，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并在紫外分光光度計下檢測其濃度，稀釋標定到10ng/μl，放入-20

6、℃冰箱里儲存?zhèn)溆??！　?.2rbcL-PCR反應體系　　PCR反應在PTC-200型梯度熱循環(huán)儀上進行，PCR擴增反應總體積為50μl，其中包括50mmol/LKCl，10mmol/LTrisHCl(pH9.0)，1.5mmol/LMgCl2，200μmol/LdNTP，50～100ng基因組DNA，1UTaq聚合酶和0.1μmol/L引物。根據(jù)Genebank上已經(jīng)公布的植物rbcL基因序列設計一對引物，用于rbcL基因片段PCR擴增，其中上游引物P1為：5＇-GAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGA-3＇

7、，下游引物P2為：5＇-ATGATCTCCACCAGACATACGA-3＇。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，PCR擴增程序為94℃變性3min；94℃50s，56℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Alpha2200凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果?！　?.3PCR產(chǎn)物的純化與測序　　使用上海生工公司柱式DNA膠回收試劑盒進行回收，由博尚生物技術(shù)有限公司測序，測序引物與PCR反應引物相同?！　?.4數(shù)據(jù)處理　　基因序列用ClustalX軟件排列，應用Seqnco

8、nverter軟件分析序列的長度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）獲得最大簡約系統(tǒng)樹；應用自展法（bootstrap）檢驗系統(tǒng)樹，自展次數(shù)為1000次。表1實驗材料來源及采集地（略）　　3結(jié)果　　3.1石斛rbcL基因序列分析　　利用Seqnconverter分析軟件對10種石斛材料進行長度、GC含量、GpC量、GC