石斛屬植物rbcl基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育初步研究

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1、石斛屬植物rbcL基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育初步研究【摘要】目的探討10種石斛植物葉綠體rbcL基因序列變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。方法根據(jù)Genebank已經(jīng)公布的植物rbcL基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于石斛rbcL基因PCR擴(kuò)增?；蛐蛄信帕杏肅lustalX軟件完成，應(yīng)用Seqnconverter軟件分析序列的長(zhǎng)度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）獲得最大簡(jiǎn)約系統(tǒng)樹；應(yīng)用自展法（bootstrap）檢驗(yàn)系統(tǒng)樹，自展次數(shù)為1000次。結(jié)果10種石斛植物葉綠體rbcL基因的長(zhǎng)度范圍為944～950bp，其中536bp為保守位點(diǎn)，4

2、66bp為變異位點(diǎn)，439bp為具有系統(tǒng)發(fā)育信息的信息位點(diǎn)?；蛑蠫C含量為40.61%～41.37%，GpC含量為4.03%～4.78%，GCskeplants.MethodsApairofprimersplifytherbcLgene.Genesequence,thecontentsofG+C,thecontentsofGpC,thevalueofGCskeaximum-parsimony(MP)method.Bootstrapanalysisplingsofthedataset.Results944～950bpnucleotidesDendrobiump

3、lants.Conservedsites,variablesitesandphylogeicallyinformativesitesphylogeny.　　Key;rbcLgene;Sequenceanalysis;Phylogeny　　石斛是我國(guó)傳統(tǒng)貴重中藥材，現(xiàn)代藥理研究證明其具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老、治療白內(nèi)障等作用［1］。由于石斛屬植物集藥用和觀賞于一體，被過(guò)度地開發(fā)利用，加上生境的破壞及自身生長(zhǎng)緩慢等原因，石斛野生資源瀕于絕滅。迄今為止，石斛屬植物的研究已在形態(tài)學(xué)、比較解剖、植物化學(xué)、同工酶和等位酶等方面積累了許多資料［2，3］。運(yùn)用PCR和DN

4、A測(cè)序等方法，從分子系統(tǒng)學(xué)角度對(duì)石斛進(jìn)行研究也有一些報(bào)道，所選擇的基因包括matK基因［4］和rRNA基因［5］。l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一種具有羧化和加氧雙重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起著重要作用。Rubisco酶由15個(gè)亞基組成，包括8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基。其中大亞基基因（rbcL）由葉綠體基因組編碼，小亞基基因（rbcS）由核基因組編碼，其中rbcL基因已經(jīng)成為分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子指標(biāo)之一。為此，本文嘗試對(duì)10種石斛植物rbcL基因進(jìn)行測(cè)序并分析，旨在為研究石斛植物的系統(tǒng)發(fā)育提供核苷酸序列方面的證據(jù)?！　?/p>

5、1材料實(shí)驗(yàn)所用石斛植物采自云南的原始森林，現(xiàn)被整叢栽種于山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室以便及時(shí)取材和觀察。見(jiàn)表1?！　?方法　　2.1總DNA的提取　　取各樣品新鮮原植物的葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA［6］，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，并在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)其濃度，稀釋標(biāo)定到10ng/μl，放入-20℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆??！　?.2rbcL-PCR反應(yīng)體系　　PCR反應(yīng)在PTC-200型梯度熱循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μl，其中包括50mmol/LKCl，10mmol/LTrisHCl(pH9.0)，1.5mmol/

6、LMgCl2，200μmol/LdNTP，50～100ng基因組DNA，1UTaq聚合酶和0.1μmol/L引物。根據(jù)Genebank上已經(jīng)公布的植物rbcL基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于rbcL基因片段PCR擴(kuò)增，其中上游引物P1為：5′-GAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGA-3′，下游引物P2為：5′-ATGATCTCCACCAGACATACGA-3′。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性3min；94℃50s，56℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Alpha2

7、200凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果?！　?.3PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序　　使用上海生工公司柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，由博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物與PCR反應(yīng)引物相同?！　?.4數(shù)據(jù)處理　　基因序列用ClustalX軟件排列，應(yīng)用Seqnconverter軟件分析序列的長(zhǎng)度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）獲得最大簡(jiǎn)約系統(tǒng)樹；應(yīng)用自展法（bootstrap）檢驗(yàn)系統(tǒng)樹，自展次數(shù)為1000次。表1實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源及采集地（略）　　3結(jié)果　　3.1石斛rbcL基因序列分析　　利用Seqnconverter分析軟件對(duì)10種石斛

8、材料進(jìn)行長(zhǎng)度、GC含量、GpC量、GC