自制脂質(zhì)體包裹米爾法蘭通過血腦屏障的研究

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1、自制脂質(zhì)體包裹米爾法蘭通過血腦屏障的研究TheresearchofMelphalanpackedwithliposomecrossingtheblood-brainbarrier實驗?zāi)康睦肧PECT分析和ELISA法比較Melphalan—輔料脂質(zhì)體a、Melphalan—普通脂質(zhì)體b和單純Melphalan等在腦內(nèi)分布的百分數(shù)和循環(huán)時間，評價脂質(zhì)體對米爾法蘭包裹后促進其通過血腦屏障的作用。米爾法蘭(Melphalan)可有效地治療多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌和子宮癌等。但是，由于其與血腦屏障中性氨基酸載體親和力很低,故全身用藥后CNS內(nèi)的濃度較低

2、。脂質(zhì)體的主要成分是磷脂和膽固醇，磷脂分子中含有親水的極性頭基和疏水尾基;膽同醇與磷脂混合后，可以改變磷脂膜的變相溫度，從而影響膜的通透性和流動性。由于這種典型的雙親分子特性，使脂質(zhì)體具有親水親油性，可以作為大分子藥物跨膜轉(zhuǎn)運的載體。本研究用脂質(zhì)體包裹米爾法蘭，且在脂質(zhì)體屮添加了各種輔料,制備出具有腦組織靶向性的脂質(zhì)體，并對其通過血腦屏障的作用進行研究。實驗內(nèi)容1.1儀器裝置及試劑1.1.1儀器裝置：85—1恒溫磁力攪拌儀；FJ-391A1型活度儀；SPECT；450nm酶標(biāo)儀。1.1.2試劑："mTc-Melphalan；脂質(zhì)體;Melph

3、alan；EIA試劑盒。1.1.3實驗動物：健康新西蘭兔3月齡(45只)，普通級，雌雄各半，體重(2.0±0.2)kgo將試驗用兔以盧戈液口服，每次5滴，每日3次，同時，在大腿內(nèi)側(cè)涂搽碘酊，每口3次，用來封閉甲狀腺及脈絡(luò)-從，減少試驗誤差。麻醉成功后將新西蘭兔15只隨機分成以下3組：①4.OmCi"niTc—Melphalan(0.05mg/kg,5只)；②4.0mCi"niTc-Melphalan—脂質(zhì)體A(0.05mg/kg,5只)；③4.0rnCi"mTc-Melphalan—普通脂質(zhì)體B(0.05mg/kg,5只)；各組均分別由耳緣靜

4、脈注入分別含有"niTc4.OmCi樣本，用以進行SPECT檢測。另將穿刺腦脊液成功后兔隨機分成4組，每組7只。分別由耳緣靜脈注入單純Melphalan、脂質(zhì)體包裹的Melphalan.單純脂質(zhì)體和生理鹽水，用以進行腦脊液采集。1.2實驗方案1.2.1"mTc-Melphalan一脂質(zhì)體的制備將自制脂質(zhì)體A、B各10mL分別倒人20mL小燒杯中，其內(nèi)各加人°加Tc—Melphalan2.0mL（含9加口24mCi）,以封口膜密封，在4°C冰箱內(nèi)、磁力攪拌器（60r/min）上持續(xù)攪拌30min即得，并測定其放射性計數(shù)。1.2.2"mTc-Me

5、lphalan一脂質(zhì)體生物學(xué)活性測定生物學(xué)活性以7?9日齡雞胚DRG鑒定，方法見文獻［2］。1.2.3SPECT測定當(dāng)1、2、3、4h時，對給藥后的各組實驗用兔進行SPECT照相（前后位），比較3組藥物靜脈注射后腦組織靶向性和體內(nèi)分布情況，測定3組標(biāo)本于1、2、3、4h時腦部及全身放射性強度，并計算出兩者Z間的比值R（R=Cntc.ofbrain/Cntc.ofallXlOO%）。1.2.4腦脊液采集將麻醉后兔置于立體定位儀上，于枕骨隆突初剪毛，消毒手術(shù)野，切開皮膚及皮下組織，顯露顱骨，屈曲顱腦。以牙科鉆斜45°方向向下刺人達枕骨大孔處，以腰

6、麻管置管，并抽出清亮腦脊液120uL于Eppendorf^屮。分別由耳緣靜脈注入上述分組標(biāo)本后，于給藥30、60>90>120min吋段抽取腦脊液120uL于Eppendorf管中。將Eppendorf管編號備用。1.2.5ELISA檢測將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到250.000,125.000,62.500,31.250,15.625,0pg/mL與樣品分別加100uL于各孔中。密封板并于37°C孵育60mino通過顛倒孔清除孔內(nèi)容物,加入250uL稀釋緩沖液，清除并重復(fù)5次，通過倒置于可吸收組織除去多余緩沖液（在進行下一步之前）。加入100uL生物素密

7、封板并于37°C孵育60mino沖洗5次,加入100HRP密封板并于37°C孵育30mino沖洗5次，加入lOOuLTMB底物，密封板并于37°C孵育（20土10）min（避光）。加入100uL終止液。混勻30s,在30min內(nèi)于A=450nm的酶標(biāo)儀上讀各孔A值。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦脊液屮Melphalan濃度?？疾熘笜?biāo)、檢測方法及意義1.1SPECT實驗結(jié)果考察指標(biāo)：SPECT顯影、腦部的放射性計數(shù)占全身放射性計數(shù)的比率R二Cntc.ofbrain/Cntc.ofallX100%檢測方法：SPECT照相（前后位）、放射性活度計

8、測定放射性計數(shù)意義：可比較Melphalan—脂質(zhì)體、單純Melphalan和Melphalan—普通脂質(zhì)體在體內(nèi)的分布及腦部的放射性計數(shù)與全身的放射性計數(shù)比值的差