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1、植物組織培養(yǎng)課程設(shè)計專業(yè)：生物科學(xué)與生物技術(shù)班級：B11學(xué)號：B11姓名：張。。。金釵石斛的脫毒、快繁技術(shù)植物組織培養(yǎng)脫毒快繁是人工在無菌條件下利用植物體的一部分，在人工控制的營養(yǎng)和環(huán)境條件下繁殖植物.脫除病毒得到無毒苗株，繼而在人田快速殖的技術(shù)。脫毒及離體快繁，這是口前杭物組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最廣泛和是有效的一個方而.主要是進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫除病毒。對于脫毒苗、新育成、新引進(jìn)、稀缺良種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等可通過離體快速繁殖，同時可不受地區(qū)和氣候的影響。比傳統(tǒng)的繁殖方法快數(shù)萬倍。植物組織培養(yǎng)己發(fā)展成為一門富有生命力的學(xué)科。脫毒與
2、快繁經(jīng)過50年世界范圍內(nèi)大規(guī)模研究，植物離體快繁的技術(shù)體系已相對成熟，其操作程序一般劃分為5個階段：1.無菌培養(yǎng)的建立（包括外植體的選擇、培養(yǎng)基、外植體的消毒和接種）2.初代培養(yǎng)；3.繼代培養(yǎng)和快速增值；4.誘導(dǎo)生根；5?馴化移栽。無菌培養(yǎng)基的建立1外植體的選擇文獻(xiàn)報道的外植體有種子、無菌苗幼苗莖段、原球莖及人工種子，其他的外植體的研究還未見報道?據(jù)研究，由種子誘導(dǎo)的愈傷組織的分化能力較強(qiáng)，而且由種胚培養(yǎng)的原球莖的質(zhì)量較高。在進(jìn)行金釵石斛組織培養(yǎng)時,初代培養(yǎng)最敏感的因子是材料的部位，其次是激素比例，基本培養(yǎng)基影響較小。2外植體處理2.1預(yù)
3、處理在取材前1?2周，把母株置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，不要給它噴水，在接種前選擇健壯無病的當(dāng)年牛長的幼株剪下，置于1000mL燒杯中，然后放在水龍頭下，用流動的自來水沖洗10min,爾后將金釵石斛幼株用無菌水漂洗2次。2.2外植體表面滅菌操作方法將預(yù)處理過的幼株放置于燒杯中，傾入75%的酒精使之沒過外植體，并輕晃以除去所附氣泡，經(jīng)過10—15s后，傾去酒精，用無菌水沖洗外植體.接著再用0.1%的氯化汞水溶液浸泡幼株8-10min,滅菌結(jié)朿后，傾出消毒液，再注入適量的無菌水，用無菌躡子攪動數(shù)次，再將水倒掉，如此重復(fù)3-4次?然后把消毒過的外植體吸干水
4、后包在無菌的濾紙屮或放在干燥滅過菌的培養(yǎng)皿里備用。在接種前先將所使用的器械（解剖刀、銀子、剪刀等）用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒，再將它們放在酒精燈的火焰上灼燒，然后放在支架上冷卻備用。3培養(yǎng)基的配制（MS母液）母液種類成分規(guī)定量mg/L擴(kuò)大倍數(shù)稱取暈/g/L母液體積ml吸取量ml母液1KNO319005095.0100020NH4NO3165050825MgSO4?7H20370501&5母液2CaC12?2H2044010022.050010母液3KH2PO41701008.550010母液4Na2-EDTA3731001.8655001
5、0FeSO4■7H2027.81001.390母液5H3BO36.21000.3150010MnSO4?4H2022.31001.115ZnSO4?7H208.61000.43KI0.831000.0415NaMoO4?2H2O0.251000.0125CuSO4-5H200.0251000.00125CoC12?6H200.0251000.00125母液6肌醇1002005.02505甘氨酸2.02000.1煙酸0.52000.025VB60.52000.025VB50.12000.0054激素在石斛繁殖培養(yǎng)基屮一般采用的激素有IBA,
6、NAA,6-BA,2,4?D,AD等,其中研究最多的是NAA和6-BAo芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素一般為6?BA,NAA.增殖培養(yǎng)基為6-BA.NAA;生根培養(yǎng)基多選用IBA.KT或NAA.在MS培養(yǎng)基上，6-BA質(zhì)量濃度為2.0-3.5mg/L時，隨著質(zhì)量濃度的增高，側(cè)芽增殖倍數(shù)隨之增大.但當(dāng)6-BA為3.5-4mg/L口寸，增殖芽雖多卻弱;NAA為0.2-0.5mg/L.有利于壯芽的成長，當(dāng)為0.8mg/L,壯芽趨勢不明顯?當(dāng)6-BA為3.0mg時，不管NAA濃度是多少，側(cè)芽增殖芽數(shù)相差不大，只是隨著一定濃度的增高芽愈壯。5脫毒選取健壯無污染
7、的組培苗，在超凈工作臺上，仔細(xì)剝離外圍組織，當(dāng)頂端分牛組織充分暴露出來后，用鋒利的解剖刀切下大小0?1-0.2mm的莖尖，使莖尖項部向上接種到不同培養(yǎng)基上。6培養(yǎng)條件培養(yǎng)基pH均為5.3左右，蔗糖、瓊脂含量分別為30g/L和7g/L,培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為20001X.光照12h/d,，培養(yǎng)溫度為25~27攝氏度。7病毒檢測抗血清鑒定法要進(jìn)行抗原的制備（包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清等）?抗血清的采收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存在?15??25°C的冰凍條件下。測定吋，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物在小試管內(nèi)混合，這一反應(yīng)導(dǎo)致形
8、成可見的沉淀。然后根據(jù)沉淀反應(yīng)來鑒定病形，即使淘汰血清學(xué)陽性反應(yīng)。二、初代培養(yǎng)將消毒好的的金釵莖尖或幼莖切成1.0cm左右，接種到MS+6-BA2.0+NAA0.5+2.0%蔗糖啟動培養(yǎng)基上，
