實(shí)驗(yàn) 微波輔助提取-高效液相色譜法測定蔬果中的vc含量

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1、主講教師：肖小華微波輔助提取-高效液相色譜法測定蔬果中的維生素C含量實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：5學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容及要求高效液相色譜簡介HPLC的使用與維護(hù)HighPerformanceLiquidChromatography一、高效液相色譜法歷史回顧；基本原理與概念；HPLC定性與定量方法；HPLC儀器組成。一、歷史回顧色譜法早在1903年由俄國植物學(xué)家茨維特分離植物色素時(shí)采用；40年代，TLC，紙色譜，柱層析；50年代，GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能；60年代末HPLC出現(xiàn)，使色譜分析范圍進(jìn)一步擴(kuò)大；1．新型固定相和檢測器2．聯(lián)用儀器：GC-MS，HPLC-MS3．智能化發(fā)展1937-1

2、972年，35年中有12個(gè)Nobel獎(jiǎng)是與色譜研究相關(guān)的！固定相——CaCO3顆粒流動(dòng)相——石油醚色帶色譜（Chromatography）一詞來源于希臘語中“chroma”=color;“graphein”=write二、基本原理當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測；兩相及兩相的相對運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)。色譜法分類1．

3、按兩相分子的聚集狀態(tài)分：氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜2．按固定相的固定方式分：平面色譜紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜3．按分離機(jī)制分：分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”缺點(diǎn)：高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開高效能——反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11-10-13g，適于痕量分析分析速度快——1min-1hr;一次可以測多種樣品應(yīng)用范圍廣——?dú)怏w，液體、固

4、體物質(zhì)化學(xué)衍生化再色譜分離、分析對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)一些基本概念1.分配系數(shù)(partitionfactor)K組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。2.分配比(partitionradio)k是指在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。在實(shí)際工作中，常用來表征色譜分配平衡過程。1、分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化；2、分配系數(shù)與分配比都

5、是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長；3、分配比可以由實(shí)驗(yàn)測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)或容量比容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系式中β為相比。容量因子越大，保留時(shí)間越長；VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；VS為固定相體積，對不同類型色譜柱，VS的含義不同；氣-液色譜柱：VS為固定液體積；氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；分配比與保留時(shí)間的關(guān)系保留因子(retentionfactor)：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；保留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：若組分和流動(dòng)相通過長度為L的分離柱，需要的時(shí)間分別

6、為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)3.色譜流出曲線（色譜圖）混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)關(guān)于色譜圖的幾個(gè)基本術(shù)語1、基線無試樣通過檢測器時(shí)，檢測到的信號即為基線。2、保留值保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的氣體或液體的保留時(shí)間；調(diào)整保留時(shí)間(tR＇)：tR＇=tR－tM也可用體積表示，對應(yīng)為保留體積、死體積和調(diào)整保留體積3、相對保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比：r21=t′R2/t′R1=V′R2/V′R1相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對

7、這兩種組分的選擇性。色譜流出曲線的意義：色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾取V柱分離效能評價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距——固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的依據(jù)。4、區(qū)域?qū)挾扔脕砗饬可V峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(?)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(W1/2)：色譜峰高一半處的寬度W1/2=2.354?（3）峰