復方君子湯誘導白血病k562細胞凋亡的機制研究

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1、復方君子湯誘導白血病K562細胞凋亡的機制研究摘要：目的本研究探討復方君子湯對抑制白血病K562細胞生長增殖和誘導凋亡的作用機制。方法用不同濃度復方君子湯作用于K562細胞，應用MTF法觀察復方君子湯對K562細胞生長增殖的影響，AnnexinV/PT染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡，Westernblot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達。結(jié)果在一定濃度的復方君子湯作用后的K562細胞的增殖被抑制，隨著濃度的增加及使用時間的延長，K562細胞的增殖抑制率及凋亡比例明顯增加；同時，Caspase-8蛋白及FaS蛋白的表達明顯上

2、升。結(jié)論一定濃度的復方君子湯可抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡，其機制可能與上調(diào)Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達有關(guān)。關(guān)鍵詞：復方君子湯；白血??；K562細胞；細胞凋亡;機制中令D分類號：R289.5文獻標志碼：A文章編號：1007-234903-0018-04白血病是一種常見的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，嚴重危害人類生命健康，細胞分化與凋亡受阻是白血病發(fā)病的重要機制之一，因此探索誘導白血病細胞凋亡的新藥是目前研究白血病治療的熱點之一。中醫(yī)認為白血病的發(fā)病是由于機體正氣虧虛，邪毒傷髓，毒瘀互結(jié)，繼而發(fā)病，治療上當遵循益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪

3、與活血化瘀三法并用之原則，復方君子湯是福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院經(jīng)過臨床實踐總結(jié)而成，在急性白血病的臨床治療中取得良好療效。為進一步研究復方君子湯抗白血病的生物學作用，筆者觀察了復方君子湯對人白血病細胞K562生長的影響，并對其相關(guān)作用機制進行了探討。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1主要試劑復方君子湯由福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院中藥制劑室提供。四甲基偶氮唑藍購自Serva公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；臺盼藍購自Chroma公司;改良型PRMI-1640培養(yǎng)基為海克隆生物化學制品公司產(chǎn)品；二甲亞砜購自北京化工廠；Annex

4、inV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。1.2細胞來源人紅白血病細胞株K562由河南省腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供。1.3主要儀器倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；水套式c02培養(yǎng)箱為長沙長棉應用技術(shù)研究所產(chǎn)品；立式滅菌器為山東新華醫(yī)療器械公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風干燥箱為上海新苗醫(yī)療器械公司產(chǎn)品；酶標儀為BIORAD公司生產(chǎn)；凈化工作臺為蘇浄集團公司產(chǎn)品；流式細胞儀為BeckmanCoulter公司產(chǎn)品；高速低溫離心機為Beckman公司產(chǎn)品。1.4細胞培養(yǎng)K562細胞使用含10%小牛血清、鏈霉素及青霉素各10

5、0U/ml的nyQ改良型PRMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于濃度為5%，溫度為37°C、濕度為100%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液1次，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。1.5MTF法測定細胞增殖抑制率選取對數(shù)生長期K562細胞按2.0xl05/ml密度分別接種于96孔培養(yǎng)板，隨機分為五組，分別為：①空白對照組;②As:03組：加入AS2O3；③復方君子湯組：加復方君子湯，每組設(shè)8個平行復孔，置于CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，分別于24h，48h.72h取各組培養(yǎng)板，每孔加入20glMTF，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心后棄上清液，加入lOOulDM

6、SO，搖勻并震蕩lOmin，在酶標儀上讀取450nm處測吸光值。計算K562細胞增殖抑制率=[1-]><100%。1.6AnnexinV/PI雙染色法和流式細胞儀檢測細胞凋亡分別收集各組培養(yǎng)24h，48h，72h后的細胞，并將其濃度調(diào)整為5.0xl05/mL。將細胞重懸浮于100

7、iL結(jié)合緩沖液。加入10uLAnnexinV和5uLPI，輕輕混勻，4°C避光反應30分鐘。再加入100

8、J結(jié)合緩沖液，在1小時內(nèi)上機檢測熒光強度，重復3次。1.7Westernblot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達收集經(jīng)10.0mg/L的復

9、方君子湯處理后的K562細胞2.0xl05/ml,經(jīng)離心、PBS緩沖液洗滌，同時設(shè)立不加藥物的空白對照組，用1xNuPAGELDS細胞裂解液裂解細胞后，采用考馬斯亮藍法測定總細胞提取液中的蛋白濃度。取30Rg經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，5%無脂牛奶封閉2h，加一抗在4°C過夜孵育，TBS緩沖液洗滌3次，二抗室溫孵育2h,化學發(fā)光法檢測蛋白表達。1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗；組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗。