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《atngb融合蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)小鼠腦缺血影響的分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、福建醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文TAT-Ngb融合蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)小鼠腦缺血影響的研究摘要背景與目的腦血管病是危害極大的常見(jiàn)病、多發(fā)病，目前缺乏切實(shí)有效的腦保護(hù)劑。腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是本世紀(jì)新發(fā)現(xiàn)的第三種攜氧球蛋白，能與氧可逆性結(jié)合，主要存在于腦內(nèi)。已有研究表明Ngb可減輕神經(jīng)元及腦組織的缺血缺氧性損傷，因此有望成為新型腦保護(hù)劑。然而，Ngb是一個(gè)大分子蛋白，無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜，更無(wú)法透過(guò)血腦屏障(blood．brainbarrier，BBB)到達(dá)腦內(nèi)，限制了它在臨床的直接應(yīng)用。吖盯蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(pro
2、teintransductiondomain，PTD)能攜帶大分子蛋白從血液中迅速透過(guò)BBB進(jìn)入腦內(nèi)。利用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將可能解決Ngb自身無(wú)法透過(guò)BBB進(jìn)入腦內(nèi)細(xì)胞發(fā)揮腦保護(hù)作用的瓶頸問(wèn)題。目前，已有離體研究表明原核表達(dá)的TAT-Ngb融合蛋白(簡(jiǎn)稱TAT-Ngb)能轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和人的胰島細(xì)胞并發(fā)揮抗缺氧損傷作用‘13，2引。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有動(dòng)物在體驗(yàn)證TAT-Ngb透過(guò)BBB功能進(jìn)入腦內(nèi)并發(fā)揮腦保護(hù)作用的研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)原核表達(dá)方法制備融合蛋白TAT-Ngb，聯(lián)合WesternB
3、lot及免疫熒光染色驗(yàn)證TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能，并用TAT-Ngb治療小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，觀察TAT-Ngb在局灶性腦缺血中的腦保護(hù)作用，探討其可能的保護(hù)機(jī)制，為腦血管病的神經(jīng)保護(hù)治療提供新的方向和思路。方法1．構(gòu)建pET28b．TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)TAT-Ngb及Ngb融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS．PAGE進(jìn)行蛋白表達(dá)高峰及可溶性分析，并行WesternBlot
4、鑒定，Ni．NTAResin親和層析柱純化蛋白，PD．10脫鹽柱進(jìn)行蛋白脫鹽。福建醫(yī)科大學(xué)博jI：學(xué)位論文2．將TAT-Ngb或Ngb尾靜脈注射近交系C57BL／6J小鼠，l或4h后處死小鼠取腦，以Ngb單克隆抗體為一抗，WesternBlot、免疫熒光染色對(duì)注射TAT-Ngb后的小鼠腦組織分別進(jìn)行Ngb蛋白定量、定位檢測(cè)，驗(yàn)證TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能。3．采用線栓法制備小鼠的MCAO局灶性腦缺血．再灌注模型，缺血時(shí)間為30min或2h。模型制備中采用以下措施以使模型穩(wěn)定：面罩吸入異氟烷麻醉；監(jiān)測(cè)并維持平均動(dòng)脈
5、血壓、血?dú)庵笜?biāo)、體溫在正常范圍；術(shù)中還通過(guò)腦血流儀監(jiān)測(cè)來(lái)判斷血流下降程度，使腦缺血程度基本一致。再灌注24h或72h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，處死動(dòng)物并制備腦組織石蠟切片，分別行HE染色、尼氏染色和TUNEL染色。4．MCAO缺血2h再灌注24h組分四個(gè)亞組，分別于MCAO前2h靜脈注射生理鹽水、Ngb或TAT-Ngb進(jìn)行預(yù)先干預(yù)，或缺血2h時(shí)(再灌注即刻)靜脈注射TAT-Ngb治療。再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，處死動(dòng)物并取腦進(jìn)行，丌C染色，測(cè)量并計(jì)算出腦梗死體積。5．MCAO缺血30min再灌注72h組分三個(gè)亞組
6、，于MCAO缺血30min時(shí)(再灌注即刻)分別靜脈注射生理鹽水、Ngb或TAT-Ngb治療。再灌注72h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，處死動(dòng)物并制備腦組織石蠟切片，使用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(Terminaldeoxynucleotidyltransferase．mediateddUTPnickend．1abeling，TUNEL)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，使用焦油紫進(jìn)行尼氏染色，在每張腦組織切片的紋狀體區(qū)觀察6個(gè)高倍視野并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)每高倍視野的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，同樣方法在尼氏染色切片中計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元和壞死神經(jīng)元，神經(jīng)元存活率
7、=存活神經(jīng)元／(存活神經(jīng)元+壞死神經(jīng)元)。結(jié)果1．成功構(gòu)建pET28b—TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)純化、脫鹽后獲得高產(chǎn)量的TAT-Ngb及Ngb融合蛋白。2．WesternBlot檢測(cè)表明TAT-Ngb注射4h后進(jìn)入了腦內(nèi)；而Ngb注射4h后未能進(jìn)入腦內(nèi)。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAT-Ngb注射lh后進(jìn)入了腦內(nèi)毛4福建醫(yī)科人學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)血管壁，4h后進(jìn)入了腦組織神經(jīng)元，在細(xì)胞漿彌散表達(dá)；而Ngb注射4h后未能進(jìn)入了腦組織。3．采用線栓法成功建立了穩(wěn)定的小鼠MCAO再灌注模型。缺血2h
8、組和30min組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為2．67+0．82和O分；2hMCAO腦缺血導(dǎo)致皮質(zhì)紋狀體梗死，而30minMCAO腦缺血導(dǎo)致局限于紋狀體的選擇性神經(jīng)元損傷。4．在MCAO缺血2h再灌注24h組，與生理鹽水組相比，缺血前應(yīng)用TAT-Ngb能明顯減少梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分(p<0．01)；而且在缺血2h后
