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《骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞與wntβ-catenin通路中β-catenin的關(guān)系分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、本課題獲得以下資助：湖南省自然基金13jj5019摘要目的擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)為死亡率較高的一種疾病，目前尚未報(bào)道其有效的治療措施。近些年研究的干細(xì)胞治療技術(shù)為它帶來(lái)了新的曙光。本研究試圖通過(guò)5-aza誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化1j擎為心肌細(xì)胞，并了解在該過(guò)程中Wnt／13．catenin信號(hào)通路是否參與分化過(guò)程的調(diào)控，旨在為臨床充分利用來(lái)源豐富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治療終末期擴(kuò)張型心肌病提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：從2009左右的SD雄性大鼠股骨提
2、取BMSCs，利用貼壁培養(yǎng)方法，篷培養(yǎng)至P3代細(xì)胞后利用流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的表面抗原：主要選取CD29、CD34、CD45、CDl05等四種表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活性。選擇活性較好，純度較高的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，隨機(jī)均勻分成a組、b組、c組、d組，分別用O岬ol／L，5I_tmol／L，lOItmol／L，201．Lmol／L的5-aza進(jìn)行干預(yù)，2周后比較總體細(xì)胞水平的活性率及心肌細(xì)胞的百分比，從而確定誘導(dǎo)分化的最佳濃度。此后將P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨機(jī)分成2組，
3、即實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為A組需加入最佳誘導(dǎo)濃度的5-aza培養(yǎng)24h誘導(dǎo)分化，經(jīng)處理后更換為不含5-aza的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間的不同分成四組，即為培養(yǎng)第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各組細(xì)胞，分別對(duì)應(yīng)為A1、A2、A3、A4四組。對(duì)照組B組不添加5-aza，參照A組的分組方法分別分為B1、B2、B3、B4四組；對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行如下操作：①記錄不同時(shí)期細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)；②行免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞中的特異性cTnT來(lái)鑒定心肌細(xì)胞，計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞百分比；③采用蛋白印跡法(westernblot,WB)檢測(cè)各組cTnT及p-eatenin
4、蛋白表達(dá)量，比較各組蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：應(yīng)用FCM檢測(cè)顯示貼壁法培養(yǎng)獲取的P3代BMSCs高表達(dá)CD29、CDl05(分別為93．37％、89．08％)；而極少的表達(dá)CD34、CD45(分別為O．89％、1．06％)。經(jīng)臺(tái)盼蘭試驗(yàn)測(cè)定其整體活細(xì)胞百分率>95％；通過(guò)對(duì)P3代BMSCs分別加入濃度為01xmol／L，519nol／L，109mol／L，209mol／L的5-aza進(jìn)行干預(yù)的a組、b組、c組、d組，2周后細(xì)胞的活性率及心肌細(xì)胞的百分率分別如下：①總細(xì)胞活性率：a組為94．2士7．4(％)，b組為93．6+7．1(％)，c組93．5+6．7
5、(％)，d組80．1+9．2(％)，將各組數(shù)據(jù)行方差分析得出，a組、b組、C組各組細(xì)胞間總細(xì)胞活性率無(wú)明顯差異，但與d組比較，P0．05，無(wú)統(tǒng)Ⅱ計(jì)學(xué)意義。綜合分析得出：C組即經(jīng)109mol／L的5-aza處理可將BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，總細(xì)胞活性率較高。由BMSC分化而來(lái)的心肌細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記特異性cTnT蛋白的免疫熒光染色后，在顯微鏡下表現(xiàn)為染紅色熒光的細(xì)
6、胞，各組心肌細(xì)胞百分比分別為：A1組及B組所有組別細(xì)胞顯鏡下未見心肌細(xì)胞形成，百分比為0(％)；A2心肌細(xì)胞百分率為3．33+1．53(％)；A3組心肌細(xì)胞百分比為19．67+1．53(％)，A4組為25．67士2．1(％)。將所得數(shù)據(jù)行方差分析得出A2、A3、A4各組間P40．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。westernblot技術(shù)檢測(cè)cTnT的表達(dá)結(jié)果，A2組(1．231+0．017)、A3組為(6．606+0．227)、A4為(8．511士0．392)明顯高于B1(O．824+0．012)、B2(0．826+0．138)、B3(O．827+0．02)、B4
7、(0．827+0．004)，A1(0．819+0．062)，A組、B組行配對(duì)t檢驗(yàn)后得出，A2與B2、A3與B3、A4與B4，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A1與B1，P>0．05，無(wú)明顯差異。A1、A2、A3、A4各組行方差分析，P<0．05，各組間存在差異；B組行方差分析則未見差異。免疫熒光與westernblot檢測(cè)cTnT結(jié)果是相一致的。各組細(xì)胞p—catenin蛋白的表達(dá)結(jié)果為：B組各組細(xì)胞p．catenin蛋白的表達(dá)檢測(cè)不出。A組各組表達(dá)如下：A1(1．877+0．044)、A2(7．634+0．329)、A3(1．084+0．092)、A4
8、(O．473+0．025)，經(jīng)方差分析得出各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：1．全骨髓貼壁法培養(yǎng)
