番茄熱誘導(dǎo)型ftsh基因的分子克隆 表達(dá)特性及生理功能

《番茄熱誘導(dǎo)型ftsh基因的分子克隆 表達(dá)特性及生理功能》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、山東師范大學(xué)博士學(xué)位論文番茄熱誘導(dǎo)型ftsH基因的分子克隆、表達(dá)特性及生理功能(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。濟(jì)南，250014)摘要FtsH蛋白酶是一種兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侶活性的兼職蛋白，在生物體內(nèi)具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多為脅迫誘導(dǎo)型；在高等植物中，F(xiàn)tsH蛋白酶與光脅迫、低溫以及病害等密切相關(guān)，但對其確切的作用機(jī)制尚不清楚。己在多種原核生物中發(fā)現(xiàn)熱誘導(dǎo)的加日基因，而在高等植物中尚未見熱誘導(dǎo)胚硼報道。為此，我們構(gòu)建了熱誘導(dǎo)的番茄cDNA文庫，通過EST分析從中分離出全長的加上理砉因，

2、將其命名為LeftsH6。對其表達(dá)特性研究充分證明其熱誘導(dǎo)表達(dá)特性；在此基礎(chǔ)上，用反向PCR法克隆了該基因的啟動子，通過凝膠阻滯和GUS表達(dá)分析研究該基因的表達(dá)調(diào)控特征。另外，我們構(gòu)建-fLeftsH6基因的過量、胞質(zhì)定位(無前導(dǎo)序列的LeflsH6eDNA)和反義的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄，獲得了各種轉(zhuǎn)基因株系，以確定番茄熱誘導(dǎo)型FtsH的生理功能。主要實驗結(jié)果如下：1．從熱誘導(dǎo)的番茄eDNA文庫中分離到全長廊玨基因并進(jìn)行了特征分析。該基因序列全長2213bp(注冊號：AB217916)，包括一個2019bp的讀碼框，

3、推測的蛋白前體定位到葉綠體中，序列中存在AAA結(jié)構(gòu)域和zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域等已知的金屬蛋白酶FtsH家族的特征結(jié)構(gòu)域。在已克隆的基因中，該FtsH與擬南芥AtFtsH6最近源，被命名為LeftsH6。利用農(nóng)桿菌侵染的方法將含有三印柵信號肽編碼序列和g彥的融合基因轉(zhuǎn)化煙草，GFP熒光表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：GFP在煙草表皮細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)，證實LeftsH6基醫(yī)]具有葉綠體定位的特性。體外蛋白酶活性分析表明，純化的FtsH具有蛋白水解活性，能降解酪蛋白但不降解BSA：突變的FtsH(Zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸Glu472突變?yōu)楣?/p>

4、氨酰胺Gin)失去了體外蛋白酶活性。Southem雜交結(jié)果表明，該基因在番茄基因組中是單拷貝；Northem和Western雜交均表明該基因表達(dá)被熱誘導(dǎo)，但其表達(dá)不被低溫、干旱、鹽脅迫、高光等脅迫調(diào)節(jié)。本研究首次證明了高等植物中存在熱誘導(dǎo)自啦趕基因。2．用反向PCR法從番茄基因組中克隆了LeftsH6基因翻譯起始位點(diǎn)上游1558bp的啟動子序列(注冊號：AB218274)，序列分析表明該啟動子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外，還含有幾組比較典型的熱激元件(HSE)。利用原核誘導(dǎo)表達(dá)的熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA2和放射

5、性標(biāo)記的fisH啟動子片段(包含HSE)進(jìn)行凝膠阻滯實驗，證實LefisH6啟動子中的HSE具有與熱激轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的能力。將LeftsH6啟動子1558bp、587bp和332bp的片段與gus報告基因融合構(gòu)建真核山東師范大學(xué)博士學(xué)位論文表達(dá)載體(pFl558、pF587、pF332)，轉(zhuǎn)化煙草。對pFl558轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性檢測表明，該啟動子驅(qū)動GUS在熱激的煙草根、葉片和花中高水平表達(dá)。各個發(fā)育時期花的子房、柱頭、花藥和萼片，以及成熟花藥的花粉粒均顯示高水平的熱誘導(dǎo)GUS染色。啟動子缺失分析表明，1558b

6、p的啟動子介導(dǎo)的GUS熱誘導(dǎo)表達(dá)是最強(qiáng)的；587bp的啟動子區(qū)域能夠介導(dǎo)GUS的熱誘導(dǎo)表達(dá)，但明顯弱于1558bp啟動子；而332bD的啟動子片段驅(qū)動的GUS熱誘導(dǎo)表達(dá)最弱。GUS熒光定量分析表明：在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中，熱誘導(dǎo)的GUS熒光活性在40℃達(dá)到高峰，與Northern雜交結(jié)果一致。在相同的熱激處理條件下，pFl558轉(zhuǎn)化系顯示出最強(qiáng)的GUS活性，顯著高于pF587和pF332轉(zhuǎn)化系。實驗結(jié)果充分表明，LefisH6是一個典型的熱激基因，其熱誘導(dǎo)特性是通過LeftsH6啟動子的HSE與熱激轉(zhuǎn)錄因子的相互作用介導(dǎo)的

7、。3．將LefisH6的全長cDNA序列構(gòu)建到組成型啟動子(CaMV35S)控制的pROK2真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法轉(zhuǎn)化番茄，獲得了過量表達(dá)LefisH6基因的轉(zhuǎn)基因番茄，通過Southern雜交證實外源基因己整合入番茄基因組，Northern雜交證實，外源fisH基因在常溫條件下的番茄轉(zhuǎn)基因株系中呈現(xiàn)組成型表達(dá)，不同的轉(zhuǎn)基因株系LeflsH6表達(dá)信號強(qiáng)度有差別。過量轉(zhuǎn)基因番茄營養(yǎng)生長正常，但生殖生長出現(xiàn)障礙。首先表現(xiàn)在花粉高度敗育，不能正常座果。通過RT-PCR／Southe

8、m雜交證實了在過量轉(zhuǎn)基因番茄的花藥中LeflsH6呈現(xiàn)組成型表達(dá)；而在未轉(zhuǎn)基因株中，只有在熱激條件下花藥中才有LeflsH6的表達(dá)。LeftsH6基因在番茄花藥中熱誘導(dǎo)表達(dá)特性的改變是引發(fā)花粉敗育的根本原因。石蠟切片觀察表明，轉(zhuǎn)基因番茄的花粉在減數(shù)分裂過程中發(fā)生異常，出現(xiàn)形狀不規(guī)則的小孢子。其次，用未轉(zhuǎn)基因番茄株的正?；ǚ圻M(jìn)行人工