資源描述：
《i3kakt通路的激活促進(jìn)her2陽性胃癌曲妥珠單抗的耐藥》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、碩士學(xué)位論文腫瘤細(xì)胞群體生長分?jǐn)?shù)高，基因組穩(wěn)定性差，因此在使用了針對某一特定分子的靶向藥后，在各種內(nèi)外源性刺激因子的作用下，腫瘤細(xì)胞群體持續(xù)不斷地動態(tài)演進(jìn)，交互式的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系相互作用，激活了新的生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而產(chǎn)生耐藥。因此，基于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療原則在腫瘤藥物治療中的應(yīng)用，不僅需要在藥物使用前明確腫瘤組織的相應(yīng)分子生物學(xué)診斷，也需要通過“液體活檢”等手段持續(xù)關(guān)注研究后續(xù)治療中各種相關(guān)信號通路的基因突變，從而探明其耐藥機(jī)制再據(jù)此設(shè)計更為有效的治療方案以更好地殺滅腫瘤細(xì)胞達(dá)到控制病情進(jìn)展甚至是治愈的目的。研究目的
2、和意義：由于曲妥珠單抗聯(lián)合化療用于治療晚期胃癌患者的客觀有效率仍然不足50％，且大部分接受曲妥珠單抗治療初始有效的患者往往在一年內(nèi)產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。因此探究曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制繼而為逆轉(zhuǎn)耐藥提供相應(yīng)的理論依據(jù)具有重要的臨床意義。目前在胃癌中曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制仍未闡明，相關(guān)文獻(xiàn)報道也較少。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞及分子水平研究了其耐藥機(jī)制，為篩選出一種新的曲妥珠單抗耐藥的分子指標(biāo)以確定更優(yōu)的目標(biāo)治療人群及克服耐藥奠定了重要的理論基礎(chǔ)。材料與方法：1．Westernblot法進(jìn)行HER2陽性人胃癌細(xì)胞株的篩選運(yùn)用Westernbl
3、ot法檢測4株人胃癌細(xì)胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、MKN28的HER2蛋白表達(dá)水平，篩選出HER2表達(dá)陽性的NCI．N87細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的研究對象用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。2．逐步增加劑量法誘導(dǎo)人胃癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞通過逐步增加劑量法誘導(dǎo)建立人胃癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系NCI—N87／TR，以MTT法檢測耐藥細(xì)胞的半藥抑制濃度IC50，并計算耐藥指數(shù)RJ。3．耐藥細(xì)胞對化療藥物的交叉耐藥111萬方數(shù)據(jù)中文摘要MTT法檢測親代細(xì)胞NCI．N87與耐藥細(xì)胞NCI．N87／TR對5．Fu、DDP、Taxo
4、l3種化療藥物的的IC50，并分別計算耐藥指數(shù)剛。4．耐藥細(xì)胞中AKT／p．AKT及PTEN基因和(或)蛋白的表達(dá)水平應(yīng)用Westernblot法檢測親代細(xì)胞NCI．N87與耐藥細(xì)胞NCI-N87／TR中AKT／p．AKT及PTEN的蛋白表達(dá)水平；利用實(shí)時熒光定量PCR檢測NCI．N87與NCI．N87／TRPTEN基因的表達(dá)。5．P13K／AKT信號通路的活化與曲妥珠單抗耐藥的關(guān)系分別以P13K抑制劑LY294002處理或siPl3K轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞NCI-N87／TR，應(yīng)用Westernblot法檢測細(xì)胞AKT／p
5、．AKT蛋白表達(dá)的變化，MTT檢測細(xì)胞對曲妥珠單抗敏感性的變化。6．PTEN基因轉(zhuǎn)染研究利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pBabe—puro-PTEN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)過菌落PCR檢測、酶切鑒定、基因測序等方法鑒定出陽性克??；將上述鑒定出的重組質(zhì)粒以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞NCI-N87／TR：應(yīng)用Westernblot法檢測細(xì)胞PTEN及下游蛋白AKT／p．AKT的表達(dá)水平；MTT檢測細(xì)胞對曲妥珠單抗敏感性的變化。7．統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均應(yīng)用SPSS21．0統(tǒng)計學(xué)軟件(IBMC
6、orporation，Armonk，NY’USA)進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，并且計算出平均值，數(shù)據(jù)以平均值士SEM的形式報告。顯著性差異均是通過單因素方差分析或Student’S．T檢驗(yàn)分析而得。各實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得P值<0．05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1．HER2陽性人胃癌細(xì)胞株的篩選對比4株人胃癌細(xì)胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、MKN28的HER2蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，NCI．N87的HER2蛋白表達(dá)量最高，因此我們選擇HER2高表達(dá)的胃癌細(xì)胞NCI-N87作為研究對象進(jìn)行下一步的耐藥細(xì)
7、胞誘導(dǎo)建立。IV萬方數(shù)據(jù)碩士學(xué)位論文2．人胃癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)建立在對NCI-N87細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，逐步增加曲妥珠單抗的濃度誘導(dǎo)NCI-N87產(chǎn)生耐藥性，當(dāng)曲妥珠單抗誘導(dǎo)濃度逐漸增加至3500p．g／ml時，NCI-N87能夠在該培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并傳代，說明已成功誘導(dǎo)建立人胃癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞，命名為NCI．N87／TR；以MTT法檢測曲妥珠單抗對NCI-N87和NCI-N87／TR的細(xì)胞增殖抑制率，并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS計算相應(yīng)的半藥抑制濃度1C50，計算耐藥指數(shù)RI(RI=耐藥細(xì)胞IC50／親本細(xì)
8、胞IC50)；結(jié)果提示，NCI-N87和NCI-N87／TR的IC50分別為19．7621ag／ml和227．52399／ml，NCI-N87／TR的耐藥指數(shù)Ⅺ為11．51。3．耐藥細(xì)胞對化療藥物的交叉耐藥MTT檢測結(jié)果提示，耐藥細(xì)胞NCI-N87／TR對Taxol和DDP存在交叉耐藥(RI=2．03和2．69，尸均為0．000)，對5-FU不耐藥(RI=0
