雙歧桿菌分離培養(yǎng)鑒定

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1、實用標(biāo)準(zhǔn)文案1設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2氣相色譜儀配FID檢測器。2.3冰箱：2℃～5℃。2.4天平：感量0.1g。2.5無菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm。2.6無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸頭。2.7無菌錐形瓶：500mL、250mL。2.8顯微鏡2培養(yǎng)基和試劑3.1BS培養(yǎng)基3.2PYG培養(yǎng)基3.3TPY培養(yǎng)基3.4NPNL培養(yǎng)基3.5X-GAL培養(yǎng)基3.6氟化鈉：化學(xué)純。3.7碘乙酸鈉或碘乙

2、酸鉀：化學(xué)純。3.8果糖-6-磷酸鹽：化學(xué)純。3.9鹽酸羥胺(HydroxyLamine-HCl)：化學(xué)純。3.10三氯乙酸(TCA)：化學(xué)純。3.11三氯化鐵（FeCl3·6H2O）：化學(xué)純。3.12甲醇:分析純。3.13三氯甲烷：分析純。3.14硫酸：分析純。3.15冰乙酸：分析純。3.16乳酸：分析純。3.17乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:吸取分析純冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,標(biāo)定,標(biāo)定方法見附錄B.1,此溶液濃度約為1mol/L。3.18乙酸標(biāo)準(zhǔn)使用液:將經(jīng)標(biāo)定的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至0.01mol/L。3.19乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:吸取分析純?nèi)樗?.4mL,移入10

3、0mL容量瓶中,加水至刻度,標(biāo)定,標(biāo)定方法見附錄B.2，此溶液濃度約為1mol/L。3.20乳酸標(biāo)準(zhǔn)使用液:將經(jīng)標(biāo)定的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至0.01mol/L。3雙歧桿菌的分離和培養(yǎng)在無菌室內(nèi)無菌稱取1g雙歧桿菌制劑，根據(jù)標(biāo)示的活菌數(shù)量，用滅菌稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL瓊脂平板上，放于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48到72小時.然后挑選菌落特征為光華、凸圓、邊緣整齊、白色或乳脂色、質(zhì)地柔軟的中小菌落，接種于TPY瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)。待長出菌落后，每個平板選5個以上的特征菌落，先進(jìn)行革蘭氏染色，挑選具有雙歧桿菌形態(tài)等特征的菌落，再進(jìn)行需氧

4、和厭氧培養(yǎng)，剔除需氧和厭氧都生長的菌落，選取僅厭氧培養(yǎng)生長的菌落，進(jìn)一步在TPY瓊脂平板上純化菌株直至鏡檢為純菌株。分純后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)，然后進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定是雙歧桿菌的菌株在TPY液體培養(yǎng)基中增菌至平穩(wěn)期，4℃，6000g×精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案15min條件下離心收集菌體分散于20%滅菌脫脂中，然后在一30一40℃條件下凍干，凍干完成后，在真空條件下壓蓋，-18℃貯存。4厭氧培養(yǎng)法液體中的厭氧培養(yǎng)采用亨蓋特厭氧培養(yǎng)技術(shù)(Min，1999;Chung，1997)。將配置好的培養(yǎng)基中加入0.01%亞甲基藍(lán)作為氧指示劑，然后將其加熱至沸騰，同時通入高純氮氣

5、，5分鐘后迅速將加熱的培養(yǎng)基放入冷水中冷卻至45℃，亞甲基藍(lán)顯示為無色則表示已經(jīng)達(dá)到厭氧，迅速蓋上橡膠塞，以上操作過程中均保持高純氮氣的不斷通入。然后將培養(yǎng)基置于121℃，滅菌21分鐘。5雙歧桿菌的鑒定（1）鏡檢（2）在基礎(chǔ)改良MRS培養(yǎng)基中添加X-Gal，對雙歧桿菌進(jìn)行檢測雙歧桿菌單獨表面涂布呈白色或淺蘭色，標(biāo)準(zhǔn)雙歧桿菌表面涂布37℃48h培養(yǎng)后,雙歧桿菌呈白色或淺蘭色,邊緣整齊,表面隆起部分顯白色,菌落背面觀察呈蘭色底暈,隨機(jī)挑取5個白色菌落經(jīng)革蘭氏染色涂片鏡檢,該菌為革蘭氏陽性,精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案呈各種分叉,V形,棍棒狀,單個,成對,或鏈狀排列,多種不規(guī)則形狀,即可基本

6、判定為雙歧桿菌。6形態(tài)特征菌株在TPY固體平板上厭氧培養(yǎng)24小時，然后進(jìn)行革蘭氏染色，對其個體形態(tài)特征進(jìn)行顯微觀察。同時把菌株接種平板上培養(yǎng)48小時，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。通過菌落及菌體形態(tài)可以看出:雙歧桿菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水樣半透明或不透明，邊緣整齊，凸起。菌體革蘭氏染色呈陽性，并呈多形態(tài)性，菌體不規(guī)則，傳代后，“V”字形和“Y”字形較少見。7生理生化檢驗糖發(fā)酵試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將雙歧桿菌合適稀釋度的稀釋液20mL接種到各糖發(fā)酵管中，37℃48h厭氧培養(yǎng)。觸酶試驗:挑取固體培養(yǎng)基18-24h內(nèi)的菌落1接種環(huán)，置于潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴(新鮮配制)，觀察結(jié)

7、果。明膠液化試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將待測菌株接種到裝有明膠培養(yǎng)基的厭氧管中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，然后置于4℃30分鐘。同時準(zhǔn)備兩只未接種的厭氧管進(jìn)行對照。吲哚試驗:將菌液置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)4天，然后在菌液中加入吲哚試劑lmL。陽性:培養(yǎng)物與試劑接觸處產(chǎn)生一紅色的環(huán)狀物。陰性:培養(yǎng)物仍為黃色。硝酸鹽還原試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將待測菌株接種于硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)，分別在3d，5d時進(jìn)行檢測。檢測時取培養(yǎng)液約0.smL于干凈的試管中，先后滴入格里斯氏試劑A