db37t3085-2017高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的rt-pcr鑒別檢測技術(shù)

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1、ICS65.020.30B41DB37山東省地方標(biāo)準DB37/T3085—2017高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)IdentificationofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainandclassicalstrainbyRT-PCR2017-12-29發(fā)布2018-01-29實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局本標(biāo)準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準rti山東省畜牧業(yè)標(biāo)準化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準起草

2、單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準主要起草人：杜以軍、齊靜、叢曉燕、陳蕾、孫文博、陳智、郭立輝、于江、吳家強、李俊、吋建立。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)1范圍本標(biāo)準規(guī)定了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作要求。本標(biāo)準適用于高致病性及經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征的實驗室診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等。2實驗室生物安全要求實驗室必須為生物安全II級（BSI-2級）及以上實驗室。3規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引

3、用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫4術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本標(biāo)準。4.1PCR聚合酶鏈式反應(yīng)。4.2SDS十二烷基硫酸鈉。5儀器設(shè)備和試劑4.1儀器設(shè)備5.1.1微量移液器（最大量程分別為10uL>20u【八lOOu【八lOOOuL）,帶濾芯的槍頭。5.1.220000r/min低溫高速離心機。5.1.3電熱恒溫水槽。

4、5.1.4穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。5.1.5水平電泳槽。5.1.6凝膠成像系統(tǒng)。5.1.7紫外透射反射分析儀。5.1.8電磁爐。4.1.9燒杯(1000mL)。5.1.10電子天平精度為：0.001go5.1.11PCR擴增儀。5.1.12組織勻漿器或研體。5.1.13-20°C冰柜。5.1.142°C?8匸冰箱。5.2試劑除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。5.2.1Trizolo5.2.2氯仿。5.2.375%乙醇。5.2.4異丙醇。5.2.5AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/uL)。5.2.6RNA酶抑制劑(40U/uL)。5

5、.2.7TaqDNA聚合酶(5U/uL)。5.2.81.0%瓊脂糖凝膠：見附錄A.1。5.2.950XTAE緩沖液：見附錄A.2.1和A.2.2。5.2.10焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水：見附錄A.3。5.2.11DNA分子量標(biāo)準DL2000o5.2.12超純水：符合GB/T6682,三級。5.2.13引物：上游引物P1:5-AAAGAYCAGATGGAGGAG-3；下游引物P2:5-TRATGGCTTGAGCTGAG-3；斜體代表兼并堿基；經(jīng)典毒株擴增片段長度大小為766bp,高致病性毒株擴增基因片段大小

6、為676bp。6操作程序6.1樣品的采集和處理6.1.1樣品的采集臨床上豬的脾、肺、淋巴結(jié)、血液等，置于-20°C冰柜或液氮中保存。6.1.2樣品的處理5.1.2.1収豬的脾、肺、淋巴結(jié)等組織約5g于研缽中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS緩沖液，研磨;血液3000r/min離心5min,分離血清。5.1.2.2陽性對照處理：髙致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的疫苗株和經(jīng)典毒株的疫苗株。6.1.2.3陰性對照處理：滅菌雙蒸水。6.2RNA的提取-Trizol法6.2.1向處理好的300PL組織樣品或血清中加入800uLTri

7、zol,重復(fù)吹打以裂解細胞（或者劇烈振蕩），冰上放置10min?25min。6.2.2加入氯仿200uL,用力振蕩30s,室溫放置5min。5.2.34°C,12000r/min離心15min,吸取上層液體500uL于1.5mbEP管中。4.2.4加入1.0mL異丙醇，-20°C沉淀RNA至少1h。4.2.54°C12000r/min離心10min,棄上清,用75%的乙醇洗滌沉淀,12000r/min離心5min,徹底棄去上清，白然條件下干燥沉淀，溶于50yLDEPC處理的滅菌雙蒸水屮，-20°C貯存，備用。也可選擇市

8、售商品化RNA提取試劑盒，完成RNA的提取。6.2.6試驗中同時設(shè)立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的疫苗株和經(jīng)典毒株的疫苗株作為陽性對照和滅菌雙蒸水作為陰性對照。6.3反轉(zhuǎn)錄表1反轉(zhuǎn)錄20uL體系序號體系組成體系含量1RXA5uL22.5mmol/LR轉(zhuǎn)錄引物（下游引物）1l?L32.5mmol/LdNTPs2uL70°C保溫5