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《GBT27517-2011鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT-PCR方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ICS11．220B41圓目中華人民共$-n國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T27517—2011鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT—PCR方法AmultiplexRT_PCRmethodtodifferentiatethehighlypathogenicandclassicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2011-11—21發(fā)布2012-03-01實(shí)施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥霎發(fā)布中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)“?標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw
2、.com免費(fèi)下載刖昌GB／T27517—20¨本標(biāo)準(zhǔn)按照GB／T1．12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(sAc／Tc181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳志明、閆若潛、張志凌、張健、荊汝頂、劉光輝、趙明軍、曹杰偉、錢(qián)勇、程俊貞、趙雪麗、張盼。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載1范圍鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT—PCR方法GB／T27517—2011本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了檢
3、測(cè)以基因組非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2編碼區(qū)缺失30個(gè)氨基酸為特征的豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性毒株與非缺失30個(gè)氨基酸的豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株復(fù)合RT—PCR鑒別診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于疑似豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染豬血清及臨床病料等樣品中的病毒核酸檢測(cè)。2試劑和儀器設(shè)備除另有規(guī)定外，所用生化試劑均為分析純。提取RNA所用試劑均應(yīng)使用無(wú)RNA酶的容器進(jìn)行分裝。2．1試劑2．1．1拭子懸液(見(jiàn)附錄A)，組織懸液(見(jiàn)附錄A)，以上試劑常溫保存。2．1．2阿氏液(見(jiàn)附錄A)，裂解液(Tr
4、iz01)，1×TAE核酸電泳緩沖液(見(jiàn)附錄A)，氯仿，0．Olmol／L(pH7．2)的PBS(見(jiàn)附錄A)，DEPC處理水(見(jiàn)附錄A)，以上試劑4℃保存。2．1．3異丙醇，75％乙醇，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，6×電泳上樣緩沖液，以上試劑一20℃保存。2．1．4陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(見(jiàn)附錄A)。2．1．5復(fù)合RT-PCR擴(kuò)增用上、下游引物序列參見(jiàn)附錄B。2．1．6鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT—PCR反應(yīng)體系組成、說(shuō)明及使用注意事項(xiàng)參見(jiàn)附錄c。2．2儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀，高速冷凍離
5、心機(jī)(離心力在120009以上)，核酸電泳儀和水平電泳槽，恒溫水浴鍋，2℃～8℃冰箱，--20℃冰箱，單道微量移液器(o．5弘L～10pL；2p．L～20pL；20肛L～200pL；100pL～1000pL)，組織勻漿器或研缽，凝膠成像系統(tǒng)(或紫外透射儀)，真空干燥器(非必備)。3樣品的采集、處理、存放及運(yùn)輸3．1樣品采集及處理過(guò)程的注意事項(xiàng)采樣過(guò)程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套、口罩、帽子。3．2樣品的采集及處理3．2．1拭子樣品3．2．1．1鼻腔拭子：采樣時(shí)要將棉拭子
6、深入鼻腔來(lái)回刮3～5次，取鼻腔分泌物。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載GB／T27517—20113．2．1．2肛門(mén)拭子：將棉拭子深入肛門(mén)轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。3．2．1．3將鼻腔拭子和肛門(mén)拭子一起放入盛有1．0mL拭子懸液的Eppendorf管中，然后將拭子懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r／min離一t710min，取上清轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。3．2．2組織樣品組織樣品采集時(shí)應(yīng)采取有明顯病變的淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟、脾臟、腎臟、胸腺等組織樣品
7、。用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品0．5g左右于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加0．3mL～O．5mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)人無(wú)菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r／rain離心10min，取上清轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。3．2．3血清或抗凝血用無(wú)菌注射器自耳靜脈或前腔靜脈采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至無(wú)菌Eppen—dorf管中，編號(hào)備用；用無(wú)菌注射器先吸人抗凝劑(阿氏液)2mL～3mL，再自耳靜脈或前腔靜脈采集等量血液，快速混勻后轉(zhuǎn)入無(wú)
8、菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。3．3存放與運(yùn)送采集或處理的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置一70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。4操作方法4．1樣品RNA的制備4．1．1取1．5mL滅菌Eppendorf管，每管加入300pL裂解液，然后分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品各100／LL，吸頭反復(fù)吸打混勻(一份樣品換用一個(gè)吸頭)；再加入100pL氯仿，充分顛倒混勻(不宜過(guò)于強(qiáng)烈)；于4℃條件下，
