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《慢病毒介導(dǎo)shrna沉默e2-2基因?qū)?nèi)皮前體細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默E2-2基因?qū)?nèi)皮前體細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響劉曉麗、馬陽、梁源、楊海捷、梁云華、王紅(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院干部病房，昆明650032)[摘要]目的構(gòu)建小鼠轉(zhuǎn)錄因子基因E2-2RNAi慢病毒載體,并觀測(cè)其沉默E2-2基因?qū)?nèi)皮前體細(xì)胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）生長(zhǎng)與增殖的影響。方法首先分離、培養(yǎng)小鼠骨髓EPCs，并予以鑒定。針對(duì)E2-2基因mRNA序列，篩選3個(gè)潛在的siRNA干擾靶點(diǎn)并予以合成；將合成的siRNA導(dǎo)入EPCs，用RT-PCR法檢測(cè)其抑制效果，以確定最佳siRN
2、A。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)最佳siRNA靶序列的shRNA，連入FT203-PLVX載體，構(gòu)建慢病毒載體FT203-PLVX/E2-2shRNA，并予以測(cè)序鑒定。測(cè)序正確者經(jīng)293細(xì)胞包裝，形成具高效感染力的E2-2shRNA慢病毒。將該重組慢病毒感染EPCs，倒置顯微鏡觀測(cè)被感染細(xì)胞的綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)變化、CCK-8（cellcountkit-8)法檢測(cè)被感染細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖；在mRNA和蛋白水平分別檢測(cè)并定量分析被感染細(xì)胞的E2-2及核抗原PCNA基因及其編碼蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果小鼠骨髓EPCs得以分離、培養(yǎng)并予以鑒定。篩選到
3、E2-2基因的最佳干擾靶序列為CGTCAGCTAGTGTTTCTAA；測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建FT203-PLVX/E2-2shRNA慢病毒載體。熒光觀察顯示，被感染細(xì)胞顯著表達(dá)GFP。CCK-8檢測(cè)表明，與對(duì)照細(xì)胞比較，沉默E2-2的EPCs的生長(zhǎng)與增殖加快，48h開始變得更為明顯（P<0.01）；mRNA和蛋白水平檢測(cè)及定量分析證實(shí)，E2-2shRNA慢病毒能有效沉默EPCs的E2-2，并上調(diào)其核抗原PCNA基因及其編碼蛋白的表達(dá)。結(jié)論小鼠骨髓EPCs得以分離、培養(yǎng)并予以鑒定。成功構(gòu)建E2-2基因RNAi慢病毒載體，該載體能有效沉默EP
4、Cs的E2-2基因，促使EPCs的生長(zhǎng)與增殖并上調(diào)其核抗原PCNA的表達(dá)。[關(guān)鍵詞]E2-2基因；RNA干擾；內(nèi)皮前體細(xì)胞；慢病毒載體[中圖分類號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]TheeffectofE2-2genesilencingbylentvirus-mediatedshRNAonthegrowthandproliferationofendothelialprogenitorcellsLIUXiao-li,MAYang,GAOYuan,YANGHai-jie,LIANGYun-hua,WangHong(Cadres’Wards,KunmingG
5、eneralHospitalofchengduMilitaryCommand，Kunming,Yunnanprovince,650032,China)[Abstract]ObjectiveToconstructaRNAinterference(RNAi)lentiviralvectortargetingmurinetranscriptionfactorE2-2geneandinvestigateitseffectongrowthandproliferationofendothelialprogenitorcells(EPCs).Met
6、hodsMurineEPCsofbonemarrowwereisolated,culturedandidentified.ThreepotentialRNAisiteswerescreenedbasedonthemRNAsequenceofE2-2geneandsynthesized.ToidentifytheoptimalsiRNAsequencebyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),thesethreesynthesizedsiRNAweretransfecte
7、dintoEPCs.ThentheshorthairRNA(shRNA)oligonucleotidetargetingtheoptimalsiRNAsequencewasdesigned,synthesizedandinsertedintoFT203-PLVXplasmidtoformFT203-PLVX/E2-2shRNAlentiviralvector.Afteridentifiedbysequencing,FT203-PLVX/E2-2shRNAplasmidwastransfectedinto293cellstoproduc
8、elentiviralparticles.ThelentiviralparticlesweretransfectedintoEPCsandtheexpressionofgreenfluorescentprotein(GF
