β―欖香烯和人血清白蛋白相互作用機制探究

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1、P一欖香烯和人血清白蛋白相互作用機制探究［摘要］B-欖香烯作為一種抗腫瘤藥物，是通過靜脈注射后隨血液循環(huán)達到靶器官發(fā)揮作用的，因此研究0-欖香烯與負責其血液運輸?shù)牡鞍字g的關(guān)系就顯得尤為重要。該實驗采用熒光分光光度計研究了欖香烯與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用機制。HSA色氨酸殘基的熒光淬滅直接反應(yīng)其與欖香烯的結(jié)合情況，研究發(fā)現(xiàn)B-欖香烯對HSA的熒光淬滅是靜態(tài)淬滅；根據(jù)計算不同溫度下的結(jié)合常數(shù)及欖香烯與HSA結(jié)合物的焙，發(fā)現(xiàn)靜電引力是B-欖香烯和HSA連接的主要原因。［關(guān)鍵詞］B-欖香烯；人血清白蛋白；熒光淬滅；靜電引力［收稿日期］

2、2014-01-29［基金項目］國家自然科學基金項目(81274180)［通信作者］劉屏，研究員，博士生導(dǎo)師，Tel:(010)66936676,E-mail：liuping301@126.com［作者簡介］張淼，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學工作,Tel:(010)66939401B-欖香烯提取自中藥材植物莪術(shù)CurcumaePhaeocaulisRhizoma,B-欖香烯無論在體內(nèi)還是體外試驗中所表現(xiàn)出的抗腫瘤作用都是非常明確的［1-4］,臨床研究顯示它還能提高病人的免疫力，且沒有明顯副作用、骨髓抑制及藥物抵抗［5］oB-欖香烯是通過靜脈注

3、射后隨血運到達靶器官的，因此B-欖香烯與人血清白蛋白(HSA)的連接狀況會直接影響B(tài)-欖香烯的吸收、分布、代謝和清除，更與其抗腫瘤的效應(yīng)密切相關(guān)。HSA是一種重要的細胞表面結(jié)合蛋白，在血清中有很高濃度的分布，具有許多特征性的重要生理功能。它由一個單多肽鏈包含585氨基酸殘基組成，分為3個結(jié)構(gòu)相似的域，每個域包含(A和B)2個子域。子域被2個二硫化物穩(wěn)固的連接［6-7］o據(jù)報道芳香族和雜環(huán)藥物與血紅蛋白的體內(nèi)轉(zhuǎn)運就是依靠與其子域IIA和子域IIIA的2個疏水袋(siteI和siteII)的結(jié)合而完成的［8-10］o當藥物與HSA發(fā)生相互作用時

4、，Trp-214殘基的熒光會被淬滅，這個特點經(jīng)常被用來當做研究藥物與HSA結(jié)合位點和結(jié)合機制的研究手段［11］。1材料F-4500熒光分光光度計(日立，日本)；B-欖香烯購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀購自北京化工廠；二甲基亞楓(DMS0)購自北京Solarbio公司。2方法2.1試劑配制PBS(pH7.4)采用1.4mmol?LTKH2P04,6.4mmol?L-lNa2HP04,137mmol?L-lNaCl和2.6mmol?L-lKC1配制而成，4°C保存?zhèn)溆茫籋SA用PBS溶解至80mol-L-l,

5、4°C保存?zhèn)溆茫籅-欖香烯配制為10g-L-1的DMSO儲存液備用。2.2不同濃度的B-欖香烯與HSA結(jié)合物的發(fā)射光譜在一系列10mL的量瓶中均加入濃度為80mol?L-l的HSA溶液，然后邊震動搖勻邊依次緩慢加入不同濃度的B-欖香烯溶液，混合均勻，使B-欖香烯的終濃度依次為0,16,32,48,64,80,112,144,176mol?LT。于室溫25°C下靜置過夜，保證反應(yīng)完全。設(shè)定激發(fā)波長為295nm,激發(fā)與發(fā)射狹縫均為5nm,用熒光分光光度計檢測80mol?L-1的HSA在PBS(pH7.4)中的發(fā)射光譜(入ex295nm)。2.3

6、檢測不同濃度B-欖香烯對HSA熒光淬滅的影響在濃度為50mol-L-1的HSA溶液中，加入不同濃度(0,10,20,30,40,50mol-L-1)的B-欖香烯，設(shè)置激發(fā)波長為295nm,用熒光分光光度計檢測B-欖香烯與HSA結(jié)合物在277,296,310K的發(fā)射光譜。3結(jié)果3.1B-欖香烯與HSA相互作用光譜當有小分子物質(zhì)連接到HSA的時候，HSA會出現(xiàn)內(nèi)熒光淬滅，即HSA上的色氨酸殘基的熒光被淬滅，因此可以通過觀察與藥物反應(yīng)前后HSA的熒光強度來判斷藥物與HSA之間是否發(fā)生相互作用。在pH7.4、反應(yīng)溫度25°C、激發(fā)波長為295nm時

7、，不同濃度的欖香烯可以使HSA的內(nèi)源性熒光強度有規(guī)律地降低，且峰型及峰位基本保持不變（圖1中A）,說明B-欖香烯與HSA之間存在相互作用。同時，B-欖香烯與HSA濃度的比值與熒光強度呈線性關(guān)系，且B-欖香烯與HSA的濃度比1：1時的斜率，說明B-欖香烯與HSA不是多重連接,而是直接連接在HSA的IIA區(qū)域Trp-214分區(qū)附近（圖1中B）o3.2熒光淬滅機制熒光淬滅分為靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅，靜態(tài)淬滅是指淬滅劑分子與熒光物質(zhì)分子之間形成了新的復(fù)合物；動態(tài)淬滅是淬滅劑分子與熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光淬滅。對動態(tài)淬滅，溫度的升高

8、將增加分子間的有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移過程，使熒光淬滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。相反，若溫度的升高降低結(jié)合物的穩(wěn)定性，使淬滅常數(shù)減小，則為靜態(tài)淬滅。可根據(jù)Stern-Volmer方程