實驗二、離心技術及物質代謝實驗

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1、實驗二、離心技術及物質代謝實驗一、離心技術【概念】根據(jù)物質沉降系數(shù)、質量、浮力因素等的不同，應用離心力使物質分離、濃縮、提純的方法?！緫谩糠蛛x、提純、鑒別生物高分子；分離線粒體、染色體、微粒體、溶酶體等亞細胞物質?！净驹怼?、離心力2n?rpmm?4n2?轉速2?rF=m?a=m?or,w=,F=6036002F：粒子在離心場中所受的離心力a：粒子旋轉的加速度m：沉降粒子的有效質量3：粒子旋轉的角速度r：粒子的旋轉半徑(cm)2、相對離心力相對離心力：離心力相對于重力的倍數(shù)，單位是gFmau)2rRCF===Gmg980RCF(r

2、elativecentrifugalforce):相對離心力rpm(revolutionsperminute):每分乍中轉速低速離心時常以轉速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示3、沉降系數(shù)(S)物質在單位離心力場下的沉降速度。S=drl?2dtu)r單位：Svedberg,1S=1OA-I3s另外，對某些生物高分子或亞細胞器組分的化學結構、分子量尚不了解時，可用沉降系數(shù)對其物理特性進行初步描述，將其區(qū)別開來，如原核生物的核蛋白體RNA(rRNA)分為5S、16S、23S,即是根據(jù)其在離心場中的行為來進行分類?！倦x心機的類型和主要構

3、造】1、類型普通離心機：<6000rpm離心機制備性離心機高速離心機：6000~20000rpm超速離心機：220000rpm實驗用離心機2、主要構造轉頭，離心管和管帽，制冷系統(tǒng)，真空系統(tǒng)，制動裝置，指示表盤【離心操作的注意事項】1、使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物，轉頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。2、每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累計期限，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。3、裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操

4、作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。4、若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。5、離心過程中不得隨意離開二、物質代謝實驗【胰島素對血糖含量的影響及測定】1、實驗目的（1）通過實驗方法證實胰島素對血糖含量的降低作用，即檢測家兔注射胰島素前后血糖濃度的改變。（2）掌握鄰甲苯胺法測定血糖濃度的方法。2、實驗原理（

5、1）胰島素降血糖的機理①促進肌肉、脂肪組織對葡萄糖的通透性，促進葡萄糖進入這些細胞;②糖原合成仁糖原分解!;③糖有氧氧化f；④磷酸烯醇式丙酮酸竣激酶合成I-糖異生I;⑤激素敏感性脂肪酶I-脂肪動員I0（2）jflL糖測定（鄰甲苯胺法）葡萄糖脫水形成（含有硼酸的冰醋酸）水浴加熱至100°C,濃酸溶液鄰甲苯胺輕甲基咲喃甲醛（疑甲基糠醛）藍綠色化合物（630nm）3、實驗方法（1）胰島素對血糖含量的影響：家兔注射胰島素前后血糖含量的變化。①取饑餓12小時家兔一只，記錄體重.②采取血標本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管擴張，然后用刀片縱行

6、切開邊緣耳靜脈，讓血液自然滴入試管屮，收集約2ml,待血凝固后，分離血清（3000rpm,5min,離心后轉移上清至一新離心管）.③按家兔體重，腹腔注射1.5單位/kg胰島素，記錄注射時間，待40分鐘后，用同樣方法取血，分離血清.④將注射胰島素前后的血清，分別測定血糖含量。⑤注意事項（a）家兔己經(jīng)饑餓12小時，在采血和注射胰島素時動作盡量溫和。（b）取耳緣靜脈要用刀片縱向割開，從尖部到根部（c）首次接觸使用離心機，離心機使用時一定要配平，并對稱放置。受離心機內空間限制，取血要用短試管。（d）試管一定做好標記。（2）JflL糖含量的測定①

7、取長試管四支,按下表操作②混勻，置沸水浴中加熱10分鐘，取出立即置冷水中冷卻.③用630nm波長，以空白管校止吸光度為0,分別測定各管吸光度值.標準液：0.490注射前：0.641注射后：0.319④計算（測定管吸光度/標準管吸光度）*標準液濃度*100二血糖（mg/100ml）注射前：130.81mg/100ml注射后:65.10mg/100ml標準液：葡萄糖標準液0.1mg/ml正常參考范圍3.9~6.1mmol/L（人）130mg/100ml（兔）【糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定】1、實驗冃的檢測糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖的牛成。PH7.4磷酸

8、鹽緩沖液：提供適宜的pH,必要的金屬離子等CCL3C00H：強酸，使糖酵解的全部酶失活一碘醋酸：與3■磷酸甘油醛脫氫酶的?SH（必需基團）起反應，使〉磷酸甘油醛脫氫酶失活。酶-SH+ICH2C00H—酶S-