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《實驗三-離心技術(shù)及酶學(xué)實驗》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗三離心技術(shù)及酶學(xué)實驗概念生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。第一節(jié)基本原理離心力當(dāng)一個粒子(生物大分子或細胞器)在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：相對離心力（RCF）通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對離心力。在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。
2、∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2r(rpm-revolutionsperminute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示第二節(jié)離心機的主要構(gòu)造和類型工業(yè)用離心機離心機制備性離心機實驗用離心機分析性離心機一、制備性離心機的三類1．普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右2．高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm（r/min）3．超速離心機：轉(zhuǎn)速可達50000～80000rpm，超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。二、轉(zhuǎn)頭1．角式轉(zhuǎn)頭2．蕩平
3、式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶(離心套管)構(gòu)成。3．區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。4．垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置的。5．連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。三、離心管塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸
4、強腐蝕性的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。離心管蓋離心前必須蓋嚴(yán)，配平時需帶管蓋重量防止樣品外泄、揮發(fā)支持離心管，防止離心管變形制備性超速離心的分離方法差速沉降離心法逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替進行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒優(yōu)點：操作簡便缺點：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法）定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。優(yōu)點：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不
5、會擠壓變形保持活性缺點：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、操作嚴(yán)格不易掌握五、離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備
6、性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。離心過程中不得隨意離開實驗內(nèi)容酶的提取及比活性測定一、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)的分離純化及比活性測定[目的]1．掌握AKP分離純化的實驗原理、方法及注意事項2．了解檢測AKP活性測定的原理和方法。方法酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電泳酶組織細胞：先破碎細胞，再用一定的試劑提取體液：直接提取方法物理方法化學(xué)方法原則制備的
7、原料初期采用、后期采用方法影響因素影響因素pH：最適pH溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機溶劑需預(yù)冷氧化：－SH對某些酶的活性必需，加入還原劑重金屬離子污染：與－SH發(fā)生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，PMSF、DFP介質(zhì)的極性和離子強度：疏水最穩(wěn)定pH評估指標(biāo)酶的純度－－用比活性代表定義：單位重量（mg）蛋白樣品中所含酶的活性單位表示方法：每mg蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位測定方法：①每ml樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)②每ml樣品中酶的活性單位酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間（秒、分鐘、小時）內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。
8、酶的回收率提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨部分酶的損失。在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收率。[原理]機械破碎法制備肝勻漿勻漿液低濃度醋酸鈉：低滲破膜 低濃度醋酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP有機溶劑沉淀法分離純化AKP加入不同有機溶劑，重復(fù)離心正丁醇：沉淀部分
