實(shí)驗(yàn)三 離心技術(shù)

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1、實(shí)驗(yàn)三離心技術(shù)一．概念生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。主要應(yīng)用于各種生物樣品的分離和制備。二．基本原理1．離心力（F）F=m·a＝m·ω2r2a：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度m：粒子的有效質(zhì)量克為單位ω：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度弧度/秒為單位r：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑cm為單位2．相對(duì)離心力（RCF）relativecentrifugeforce通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，因而稱為相對(duì)離心力（RCF）。或者用數(shù)

2、字×g來表示，例如：13，000g，則表示相對(duì)離心力為13，000。相對(duì)離心力指在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。RCF=ma/mg=mω2r2/mg=ω2r2/gω=2π×rpm/60∴RCF=1.119×10－5×（rpm）2rrpm：revolutionsperminute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)由上式可知，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，每臺(tái)離心機(jī)的離心管從管口至管底的各點(diǎn)與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計(jì)算時(shí)規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半

3、徑rav代替：rav＝（rmin＋rmax）/2低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速rpm來表示，高速離心時(shí)則以g表示。報(bào)告離心條件時(shí)使用RCF比rpm要科學(xué)，因?yàn)樗梢哉鎸?shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動(dòng)態(tài)變化。三．離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型1．離心機(jī)的分類工業(yè)用離心機(jī)制備性離心機(jī)：分離各種生物材料、分離的樣品量比較大實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)分析性離心機(jī)：研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，一般有光學(xué)系統(tǒng)，可監(jiān)測(cè)粒子在離心場(chǎng)中的行為，能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等，都是超速離心機(jī)制備性離心機(jī)分為：（1）普通離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，最大RCF接近60

4、00g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，室溫操作，用于收集易沉淀的大顆粒物質(zhì)，如：細(xì)胞等（2）高速冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速為2000－25000rpm，最大RCF為8900×g，最大容量可達(dá)3L，一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0℃－4℃，可以嚴(yán)格準(zhǔn)確的控制轉(zhuǎn)速溫度和時(shí)間，并有指針或數(shù)字顯示。通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫酸銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器、或單個(gè)分子。（3）超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速可達(dá)

5、50000－80000rpm，RCF最高可達(dá)510000×g，離心容量由幾十毫升至2升，分離形式為差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，需嚴(yán)格配平（誤差<0.1g）。可分離亞細(xì)胞器、病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。2．轉(zhuǎn)頭（1）角式轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。一般有4－12個(gè)裝離心管的離心管腔，離心管腔的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20°－40°之間，角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好。壁效應(yīng)：顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”。（2）蕩平式轉(zhuǎn)頭吊籃式（3）

6、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭（4）垂直轉(zhuǎn)頭（5）連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭3．離心管（1）制作材料塑料：聚乙?。≒E）,聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP），PP性能較好優(yōu)點(diǎn)：透明或半透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)：易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短不銹鋼：優(yōu)點(diǎn)：強(qiáng)度大，不變形，能抗熱、抗凍、抗化學(xué)腐蝕。避免接觸腐蝕性的化學(xué)藥品，如：強(qiáng)酸，強(qiáng)堿等。（2）離心管蓋離心前必須蓋嚴(yán)，配平時(shí)需帶管蓋重量管蓋作用：①防止樣品外泄②防止樣品揮發(fā)③支持離心管，防止離心管變形四．制備性超速離心的分離方法1．差速沉降離心法最普通的離心法，采用逐漸增加離心速度或低速、高速交替進(jìn)行離心

7、，使不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法，此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡易，離心后用

8、傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。2.密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)