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《非洲豬瘟病毒TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)第28卷第1期V01．28No．1寧夏大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofNingxiaUniversity(NaturalScienceEdition)2007年3月Mar．2007文章編號：0253—2328(2007)01—0056—04非洲豬瘟病毒TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立李維彬1’2，蔣正軍¨，王玉炯孫，龔振華1，許崇波2，郭福生1，鄭增忍1(1．農(nóng)業(yè)部動物檢疫所，山東青島266032；2．寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川750021)摘要：為建立一種快速、準確、特異的非洲豬瘟病毒(MricanSwineFeverVirus，ASFV)定量檢測
2、方法，根據(jù)TaqMan探針熒光定量分析原理，對ASFV核酸進行了實時熒光定量PCR分析．借助計算機軟件輔助，對ASFV基因序列及檢測引物和探針進行了優(yōu)化篩選，利用pET-ASFVP72質(zhì)粒作為參比模板對PCR反應(yīng)的M釅+、引物、探針濃度等參數(shù)進行了優(yōu)化，其最佳濃度分別為4．5mmol／L，400nmol／I，和500nmol／L．同時，對靈敏度、特異性、定量線性關(guān)系、精確度等進行了評估，最低檢出量為102個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，特異性為100％，CT(CycleThreshold)值的變異系數(shù)CV小于5％．對送檢的15份(是否感染ASFV不確定)豬肉樣品進行檢測，結(jié)果全為陰性．試驗表明，所建立
3、的實時熒光定量PCR檢測方法能夠快速、準確、特異、靈敏地對ASFV核酸進行定量分析，從而為非洲豬瘟的檢測提供了一個新的、可靠的方法．關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；TagMan探針；實時熒光定量PCR分類號：(中圖)S854．57；s852．695．5文獻標志碼：A非洲豬瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)引起的一種豬的烈性、高度接觸性傳染病[1]．ASF自1921年在肯尼亞首次報道以來，截至目前，該病流行于撒丁島及鄰近撒哈拉沙漠的部分非洲國家，在葡萄牙、西班牙、意大利及美國南部等地也屢有發(fā)生[2]．由于亞急性、慢
4、性ASF的存在，且該病與其他發(fā)熱性豬病的臨床癥狀和病理損傷有很大的相似性，因此對該病的診斷有一定的困難．目前，針對ASFV的檢測和診斷技術(shù)主要有2大類，即基于病毒抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法和針對病毒DNA的核酸檢測技術(shù)．用免疫學(xué)方法檢測抗體可以了解病毒感染以及疾病發(fā)生、發(fā)展的進程，然而，由于抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現(xiàn)，因此，抗體檢測在作為快速控制ASFV暴發(fā)的方法時存在局限性．PCR可以檢測出各種樣本(血液、糞便、分泌物、組織切片)中ASFV的遺傳物質(zhì)DNA，從而實現(xiàn)早期診斷，在ASFV的診斷和檢測中具有重要的作用．近幾年發(fā)展起來的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法將P
5、CR與熒光檢測結(jié)合起來，克服了傳統(tǒng)PCR費時、易污染，擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點，可對樣品中的核酸進行準確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為病原體檢測的重要方法．本文根據(jù)TaqMan探針熒光定量分析原理，對ASFV核酸進行了實時熒光定量PCR分析，建立了一種快速、準確、特異的ASFV定量檢測方法．1材料與方法1．1材料與試劑DNAEngineOpticonTM全自動熒光定量PCR儀(MJReasearch公司)，HitachiU一2000紫外分光光度計．TaqPolymerase，質(zhì)粒純化試劑盒SKⅢI均購自上海生工生物
6、工程有限公司．1．2實時熒光定量PCR分析系統(tǒng)的建立1．2．1參比模板的構(gòu)建以實驗室構(gòu)建的pET-ASFVP72作為參比模板(含ASFVP72全基因)．1．2．2引物和探針的設(shè)計用DNAStar分析軟收稿日期：2005—04—15作者簡介：李維彬(1981一)，男，碩士研究生，主要從事微生物基因工程研究．*通訊聯(lián)系人：蔣正軍(1964一)，男，副研究員，博士，主要從事病原微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，(電子信箱)jiangzhengjun@epizoo．org王玉炯(1963-)，男，教授，博士，主要從事微生物基因工程研究，(電子信箱)wyi@nxu．edu．cn．萬方數(shù)據(jù)萬方數(shù)據(jù)58寧夏大學(xué)
7、學(xué)報(自然科學(xué)版)第28卷表1引物和探針濃度配比的CT值對10z～108個拷貝范圍內(nèi)的模板進行準確定量．2．1．2MgCl2濃度的確定Mg+濃度是影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，本研究用2．0，2．5，3．0，3．5，4．0，4．5，5．o，6．0mmol／L不同濃度的M92+對實時熒光定量P(、R檢測效果的影響進行比較．結(jié)果表明，Mg+濃度對CT值有一定的影響，M礦+濃度為4．5mmol／L時CT值最小，檢測效果最好，結(jié)果見表2．表2Mg*+濃
