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《bdnf基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及對耳蝸螺旋神經(jīng)元保護(hù)作用初步研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文BDNF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及對耳蝸螺旋神經(jīng)元保護(hù)作用初步研究姓名：劉謙虛申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：謝鼎華20090501博士學(xué)位論文中文摘要第一章人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)目的神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactors，NTFs)在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、功能維持過程中發(fā)揮重大影響。近年來神經(jīng)營養(yǎng)因子家族一些成員紛紛被克隆并應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治，取得了可喜進(jìn)展。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain—derivedneur
2、otrophicfactor，BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，與外周聽覺系統(tǒng)有著密切關(guān)系，不僅對耳蝸前庭神經(jīng)元的發(fā)育成熟、增殖分化起重要作用，而且對損傷后神經(jīng)元的修復(fù)、存活與功能重塑也影響深遠(yuǎn)。在此基礎(chǔ)上，本研究對人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(humanBDNF，hBDNF)進(jìn)行克隆，構(gòu)建hBDNF真核表達(dá)載體pcDNA3．1(．)一BDNF，并用該載體轉(zhuǎn)染人胚胎腎293細(xì)胞(humanembryokidney293cells，HEK293)后檢測BDNF的表達(dá)，為耳聾防治的進(jìn)一步研究提供了基因來源。方法RT．P
3、CR擴(kuò)增人胚胎腦組織hBDNF基因片段，將基因片段與pcDNA3．1(．)質(zhì)粒連接制成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化、篩選及擴(kuò)增重組質(zhì)粒，用EcoRI和BamHI酶切分析鑒定BDNF是否插入重組質(zhì)粒。小量提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行測序分析，將酶切檢測和測序正確的pcDNA3．1(．)．BDNF重組質(zhì)粒用QIAGEN．TIPl00大量提取。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，WesternBlot法檢測細(xì)胞中BDNF的表達(dá)。結(jié)果應(yīng)用RT．PCR技術(shù)克隆出hBDNF基因。將hBDNF片段與pcDNA3．1(．)連接，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA
4、3．1(一)一BDNF。酶切博士學(xué)位論文中文摘要鑒定、DNA序列測定結(jié)果證實(shí)插入片段為hBDNF基因全長片段。WesternBlot法檢測到轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(．)一BDNF的HEK293細(xì)胞中有BDNF的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了含hBDNF基因的真核表達(dá)載體：pcDNA3．1(一)．hBDNF，為開展基因治療提供了重要的基因來源。關(guān)鍵詞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，質(zhì)粒，構(gòu)建，表達(dá)第二章腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因電穿孑L法轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞觀察目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone—malTOW
5、mesenchymalstemcells，BMSCs)在轉(zhuǎn)染人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因后在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的功能。方法人BDNF基因克隆并構(gòu)建其真核表達(dá)載體。取5只豚鼠的骨髓，分離培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，觀察其形態(tài)。CD34、CD44、CD45抗體流式細(xì)胞術(shù)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。將人BDNF基因電穿孔法轉(zhuǎn)染BMSCs，G418篩選后用維甲酸(RA)誘導(dǎo)分化，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋1芻(GFAP)抗體免疫細(xì)胞化學(xué)對分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果分離培養(yǎng)的細(xì)胞
6、具有典型的BMSCs形態(tài)和標(biāo)志，人BDNF基因電穿孔法轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染率約為25％，轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后的細(xì)胞在外觀上類似神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE、Nestin和GFAP。Ⅱ博士學(xué)位論文中文摘要結(jié)論BDNF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs在體外能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，電穿孔法能提高轉(zhuǎn)染率，RA有促誘導(dǎo)作用。關(guān)鍵詞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，電穿孔，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，神經(jīng)元樣細(xì)胞第三章腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞耳蝸內(nèi)移植初步觀察目的探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在受損耳蝸內(nèi)的分化及保護(hù)功能。方法將轉(zhuǎn)染了腦
7、源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，并在體外誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BDNF．BMSCs)標(biāo)記后，通過鼓階注射植入阿米卡星致聾的豚鼠耳蝸內(nèi)。并設(shè)耳蝸單純注射人工外淋巴液、BMSCs、BDNF基因作為對照組。分別在注射后lW、2W、4W取耳蝸組織石蠟包埋切片。HE染色觀察耳蝸組織病理學(xué)變化，計(jì)算SGNs密度；了解BMSCs的分布；NSE、Nestin和GFAP抗體免疫組織化學(xué)，觀察BMSCs在蝸內(nèi)的分化和SGNs的存活情況。結(jié)果阿米卡星致聾后豚鼠耳蝸結(jié)構(gòu)受到損傷，SGNs數(shù)減少。誘導(dǎo)分化前后的BMSCs在耳蝸內(nèi)均能成活并
8、分布到一定的區(qū)域。NSE、Nestin和GFAP免疫化學(xué)可見誘導(dǎo)分化后的BMSCs部分細(xì)胞陽性染色，而未誘導(dǎo)分化的BMSCs陽性細(xì)胞較少。用平均光密度(averageopticaldensity，AOD)分析免疫化學(xué)結(jié)果顯示：耳蝸內(nèi)BDNF—BMSCs在lW、2W時(shí)保持了較高的AOD值，和體外比較無明顯區(qū)別，TTT博十學(xué)位論文中文摘要但在4W時(shí)顯著下降(P
