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《鈣激活酶激活因子（uk114）嫩化肉的研究及其cdna克隆和表達(dá)載體構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、中國(guó)農(nóng)業(yè)人學(xué)博Ij學(xué)位論史(20026)摘要肉的嫩度是肉類品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)，提高肉的嫩度一直是肉類l。業(yè)的重要研究課題。鈣激活酶系統(tǒng)(calpains)是動(dòng)物宰后導(dǎo)致肌肉嫩化的重要酶系統(tǒng)，鈣激活酶激活岡子(caJpainac￡jva￡or)是鈣激活酶(caJpajn)的激活蚩岡子，是caJpain的止調(diào)協(xié)網(wǎng)子。但是，目前天r該激活蛋白的研究還很少。本論文對(duì)uKll4的肉嫩化作用進(jìn)行了研究，構(gòu)建了山羊肝臟cDNA文庫(kù)，根據(jù)colombo等1998(colomboeta1．，1998)報(bào)道的uKll4的cDNA序列克隆了calpainac
2、tivatorcDNA，進(jìn)行了序列測(cè)定，行構(gòu)建了人腸桿菌表達(dá)載體，同時(shí)也對(duì)該表達(dá)載體進(jìn)行了鑒定。㈠．uKll4嫩化牛肉的研究表明：宰后1小時(shí)，注射3％的8mMuKll4可以顯著地降低牛肉的剪切力，宰后1天牛肉的嫩度就有明顯的提高，2天時(shí)完成成熟。2．uKll4處理肉導(dǎo)致肌肉肌原纖維小片化指數(shù)升高，使肌原纖維z。線斷裂，從而促進(jìn)肉的嫩化。3．山羊肝臟總RNA的提取：_Hj組織勻漿器破碎組織，JL}jProme2a『總RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)甲醛凝膠電泳檢測(cè)，有明顯的28srRNA和18srRNA條帶。4．山羊肝臟mRNA的提?。河?/p>
3、安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司mRNA提取試劑盒提取山羊肝臟mRNA，mRNA的得率為l一5ug，o．19材料，mRNA的濃度為19．52ug，ml，經(jīng)甲醛凝膠電泳檢測(cè)，mRNA分布于500bp到3kb之間。5．用安發(fā)瑪西弧生物技術(shù)公司cDNA合成試劑盒、Prome2ar公司噬菌體包裝蛋白等試劑盒構(gòu)建了克隆于^昏10的非表達(dá)型cDNA文庫(kù)，所構(gòu)建cDNA文庫(kù)的滴度2．6×106p叫mI，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，cDNA插入片段大于1kb。6．PcR擴(kuò)增calpainactivatorcDNA：采用平板裂解物法提取噬菌體DNA作為模板，根據(jù)uKll
4、4的cDNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物：引物1(5‘)：5—gaccatggcat豇cttctttga一3和引物2(3)：5一gaggatccaatctgcatgctamcatttcca一3，經(jīng)PcR獲得了一個(gè)長(zhǎng)度約為1kb的cDNA片段。7．calpainactivatorcDNA的克隆與序列分析：用常規(guī)基因克隆技術(shù)把calpainactivalorcDNA基因經(jīng)^一T連接插入pGEM—T克隆載體，進(jìn)行測(cè)序和序列分析。結(jié)果表明，該序列全常泓：¨激活酶激活協(xié)I子(uKll4)肉嫩化的研究及，#cDNA的克降‘j表達(dá)載體的構(gòu)吐K1()17bp，f
5、r個(gè)丌放的閱讀框(40nt450nt)，¨J編碼137個(gè)氨基酸(14．2kDa)。calDamactivatorcDNA‘JuKll4的序列比較．同源性為91％，突變的86個(gè)核越：酸中都為尤義突變，開放閱讀框中儀仃～個(gè)核茁=酸突變。將克隆的calpainactivatorcDNA推導(dǎo)的氮叢酸序列‘JMeJlonjeI，a
6、1998年報(bào)道的從牛腦中提取純化的鈣激活酶激活蚩門的氯基酸序列比較㈨游’陀為98％。8．calpajnactjVatorcDNA表達(dá)載體的佝建：_L}jBamHI和Nco1分別酶切rcR，虹物和pBV221質(zhì)粒載體，同
7、收小片段，然后把它們連接起來(lái)，構(gòu)建得到DBv221uKll4(簡(jiǎn)稱pBvl14)表達(dá)載體。9．calpainactiVtorcDNA表達(dá)載體的鑒定：將質(zhì)粒pBvll4轉(zhuǎn)染BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，選抒日{(diào)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，瓊脂糖檢測(cè)獲得約1kb和3．7kb的兩個(gè)片段。犬鍵訶：鈣激活酶馓活網(wǎng)子uKll4嫩化克隆表達(dá)載體中國(guó)農(nóng)業(yè)人學(xué)博士學(xué)位論史(20026)Abstract7I、hetendemessofmeatisanimponantindextoapprajsethequalityofmeatToimproVeIhetende
8、messofmeatjsalwaysimportantforstudyinmeatindustryThecalpainproteaSesystemisthoughttoplayanimportantroleinthepostmortemtende“zationofmeatThecalpainactivatorjsaproteinlhatsmnuJalestheactjvitiesofca
9、pajns．AJfhou曲jtislheposjtjvefac￡orofcalpain’studiesofthjscalpa{nactivatorha
10、vebeenscarceFirstly，westudiedthee仃ectsofUKll4onmeattendemess．Secondly，weconstructedthegoatliVercDNAlibr
