木薯醇腈酶cdna的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建

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1、木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建作者：王丹　何浪　王玉明　潘克儉　李維【摘要】　　目的克隆木薯醇腈酶（HNL）cDNA構(gòu)建表達(dá)載體，以實(shí)現(xiàn)木薯醇腈酶基因的高效表達(dá)。方法運(yùn)用RT-PCR從木薯幼葉組織中擴(kuò)增出HNL全長(zhǎng)cDNA序列，將其克隆至質(zhì)粒pBluescriptSK中進(jìn)行序列分析，再利用PCR將其再克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K上。結(jié)果經(jīng)測(cè)序分析表明，克隆的cDNA片段和Lane1:λDNA/HindIIImarker;Lane2:RT-PCRproductLane3:pBS/EcoRI;Lane4:pBS-HNL/EcoRI＋BamHI圖2電泳分析RT-PCR產(chǎn)物及限

2、制酶切分析陽性克隆Fig.1ElectrophoresisanalysisofproductbyRT-PCRandanalysisofpositivecloningbyrestrictiveenzymetechnique2.2表達(dá)載體的構(gòu)建為了在甲醇酵母中表達(dá)木薯HNL，根據(jù)質(zhì)粒pPIC3.5K限制酶分布位點(diǎn)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下引物：上游引物Hnl-35′-gcggatccatggtaactgcac-3′下游引物Hnl-45′-gcgaattcaagcatatgcatc-3′其中上游引物引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加上EcoRⅠ位點(diǎn)，以質(zhì)粒pBS-HNL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端

3、分別含有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的HNL片段，將其雙酶切后與經(jīng)同樣處理的pPIC3.5K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐的LB平板，培養(yǎng)過夜，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落于液體LA中，培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳，選取增大的質(zhì)粒DNA，為可能的重組子。用限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)生了0.8Kb的片斷，與預(yù)期相符（圖4）。證明為所需的重組子，命名1道:經(jīng)HindⅢ酶切的λDNA標(biāo)準(zhǔn);2道:無;3道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ+EcoRⅠ;4道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ圖4酶切鑒定重組子pPIC3.5K-HN

4、LFig.4RegestiondetectionofpPIC3.5K-HNL為pPIC3.5K-HNL，其構(gòu)建流程見圖5。圖5重組質(zhì)粒pPIC3.5K-HNL的構(gòu)建流程Fig.5ThecourseofConstructionofrebinantplasmidpPIC3.5K-HNL3討論已有的研究結(jié)果表明，木薯基因組中含有多個(gè)HNL基因成員，已確定序列的有至少3個(gè)成員，包括mehnl10,mehnl14,mehnl24以及clonhnl（可能為新成員）。將本研究獲得的醇腈酶cDNA與已報(bào)道的，同源性較高的序列進(jìn)行了序列比較，結(jié)果顯示與Me-HNL10cDNA序列的同源性為99.1%，氨基

5、酸序列同源性為98.8%，與colnhnlcDNA序列的同源性為98.8%，氨基酸序列同源性為98.1%。但根據(jù)同源性比較結(jié)果，我們還不能確定本研究中克隆的HNL屬于其中的哪一類成員。甲醇酵母（pichiapastoris）表達(dá)系統(tǒng)是一種較好的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，它的蛋白質(zhì)加工方式和高圖3克隆的木薯HNLcDNA序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.3Nucleotideanddeducedaminoacidsequencesofα-hydroxynitrilelyasecDNAfromcassava陰影部分表示:克隆到的木薯HNLcDNA序列與Me-HNL10cDNA相比,堿基對(duì)不同的部分;黑體

6、部分表示：與colnhnlcDNA相比,堿基對(duì)不同的部分.方框部分表示:根據(jù)克隆的木薯HNLcDNA序列所推測(cè)的其氨基酸序列與Me-HNL10相比不同的部分;下劃線表示:與colnhnl相比不同的部分。ShadoinoacidsequencesparedtoMe-HNL10;Underline:thedifferentpartofdeducedaminoacidsequencesparedtocolnhnl.等真核生物相似，為理想的高等真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)［9］。目前國(guó)外從多種植物中克隆了HNL基因,其中Hasslacher等將來自三葉膠的HNLcDNA分別在大腸桿菌、釀酒酵母和甲醇酵母中實(shí)

7、現(xiàn)了表達(dá)，研究結(jié)果表明三葉膠HNLcDNA在甲醇酵母中表達(dá)量最高，目的產(chǎn)物可達(dá)可溶性總蛋白的30%［10］；而Haughes等在大腸桿菌中表達(dá)了來自木薯的hnl基因［11］。國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道在大腸桿菌中表達(dá)木薯HNL基因，酶活力為2100U/L發(fā)酵液［8］，但無在甲醇酵母中表達(dá)的報(bào)道。為了進(jìn)一步提高木薯HNL的表達(dá)量，本項(xiàng)研究將木薯HNL插入到甲醇酵母pPIC3.5K中，成功構(gòu)建甲醇酵母表達(dá)載體，下一步將構(gòu)建工程菌，完善發(fā)酵條件，以