骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對腦梗死大鼠治療作用的研究

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1、中文摘要骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對腦梗死大鼠治療作用的研究摘要目的：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴增；B．巰基乙醇體外誘導其向神經(jīng)組織分化，電鏡及免疫細胞化學染色法鑒定分化細胞方向；Longa改良線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型，觀察第4代骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對成模大鼠的治療效果；明確骨髓間充質(zhì)干細胞是否可經(jīng)血液循環(huán)歸巢至受損腦區(qū)；是否可在腦內(nèi)存活、遷移、并

2、向神經(jīng)組織分化；是否促進神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor，NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(Brain．drivedneurotrophicfactor，BDNF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的分泌；是否減少腦缺血半暗帶區(qū)細胞凋亡。以此探討B(tài)MSCs的生物學特性及靜脈移植治療大鼠腦梗死的效果和機制。方法：1取3～4周齡的健康雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，傳代擴增，取第4代細胞進行誘導分化，

3、倒置相差顯微鏡下進行形態(tài)學觀察。2按照Woodbury方案進行預(yù)誘導和誘導。L．DMEM培養(yǎng)基+lmmol／LB．巰基乙醇+20％FBS預(yù)誘導24小時后，L．DMEM+5mmol／LB．巰基乙醇誘導5小時，之后去除誘導中文摘要液為常規(guī)培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2周?！?誘導后進行細胞鑒定：倒置相差顯微鏡下觀測細胞形態(tài)學變化；透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變；免疫細胞化學染色法對誘導細胞進行神經(jīng)前體細胞表面標志(神經(jīng)上皮巢蛋白nestin)、神經(jīng)元細胞表面標志(神經(jīng)元特異性烯醇化酶neuronspecificenolase，NSE

4、)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面標志(膠質(zhì)纖維酸性蛋白glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的鑒定。4第3代BMSCs傳代、換液后進行Brdu標記，時間大約3天，待第4代細胞長滿瓶底時收集細胞，待移植。5健康雄性成年SD大鼠(3月齡，體重270．3009)，Longa改良線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型。取成模大鼠50只隨機分成兩組，BMSCs移植組和PBS對照組，每組25只。6于MCAO24h后，將Brdu標記的第4代B

5、MSCs細胞lmL(含3x106個細胞)從尾靜脈植入BMSCs組大鼠，對照組同樣途徑給予等量PBS。于MCAO后1天(移植前)、移植后7、14、21天各組大鼠分別進行改良神經(jīng)功能缺損評分(modifiedNeurologicalSeverityScores，mNSS)；移植術(shù)后7天，各組大鼠分別隨機取5只進行TTC染色測定梗死體積；再于同一天和第14、21、28天兩組各處死大鼠5只，灌注取腦，多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作石蠟切片。分別行HE染色觀察腦缺血病理改變；TUNEL染色觀察細胞凋亡

6、；免疫組織化學染色鑒定移植入腦的BMSCs及分化以及NGF、BDNF、VEGF等因子的分泌。7統(tǒng)計學處理中文摘要實驗數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，資料采用SPSSll．5統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。兩組間同一時間點樣本均數(shù)采用兩獨立樣本t檢驗，同一組內(nèi)不同時間點組間均數(shù)之間采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(i土S)表示，以P

7、態(tài)。傳代后，細胞形態(tài)逐漸純化，至第4代，形態(tài)單一，呈長梭形，漩渦狀和平行排列生長。2預(yù)誘導后細胞形態(tài)無明顯變化，加入誘導液后細胞形態(tài)迅速改變，誘導5小時部分細胞漂浮、崩解、死亡，細胞形態(tài)不再發(fā)生明顯改變，大部分細胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)。之后用常規(guī)培養(yǎng)基替換誘導液，一周以后，大多數(shù)細胞仍為神經(jīng)元樣形態(tài)，第2周細胞形態(tài)緩慢改變，2周時，細胞形態(tài)逐漸回到誘導前扁平的梭形狀態(tài)。3誘導后細胞神經(jīng)標志物的免疫細胞化學檢測顯示：空白對照組Nestin、NSE、GFAP均無表達。其余組，GFAP均為陰性。預(yù)誘導組Nestin陽性細胞表

8、達，Nestin陽性細胞數(shù)在誘導1h后達到高峰，約為29．35％，誘導5h時幾乎測不到。NSE陽性細胞率隨誘導時間延長逐漸提高，誘導5h時NSE的陽性率約為57．53％。Nestin、NSE兩個指標預(yù)誘導24h，誘導1h，誘導5h三個時間點陽性細胞率比較均有統(tǒng)計學意義(P