青蒿素生物合成相關(guān)基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究

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1、中國(guó)科學(xué)院植物研究所博士學(xué)位論文青蒿素生物合成相關(guān)基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究姓名：李振秋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：葉和春;李國(guó)鳳20070131中文摘要青蒿素生物合成相關(guān)基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究從中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物青蒿(ArtemisiaaliliuaL．)中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一類新型的抗瘧特效藥，特別是對(duì)抗氯喹的惡性瘧疾和腦型瘧疾有很好的療效。由于青蒿素在植物中的含量極低，使得其價(jià)格很高，特別是對(duì)于亞非拉等第三世界國(guó)家來(lái)說(shuō)。因此如何提高青蒿素的產(chǎn)量成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。各種傳統(tǒng)的育種、生理生化手段和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)均未取得較好的結(jié)果，因此，利用植物

2、基因工程技術(shù)提高青蒿素產(chǎn)量已成為研究的重點(diǎn)之一。本論文圍繞青蒿素的生物合成途徑開(kāi)展了以下的工作：一、中藥青蒿紫穗槐二烯合酶的大腸桿菌表達(dá)、純化與功能鑒定利用RT-PCR方法，從中藥青蒿高產(chǎn)株系001中克隆到的中藥青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS)cDNA，其推測(cè)編碼蛋白與靜人報(bào)道的有兩個(gè)位點(diǎn)的突變。將其開(kāi)放閱讀框插入到原核表達(dá)載體pET30a(+)的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建N端攜帶有HIS6表達(dá)標(biāo)簽的紫穗槐二烯合酶重組表達(dá)載體pETADS。將pETADS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG(Isopropyl-beta．D—thiogalactoside)誘導(dǎo)重組紫穗槐二烯

3、合酶的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖柱純化。純化蛋白加入酶促反應(yīng)體系(含F(xiàn)PP)，GC．MS分析酶促反應(yīng)體系的正己烷萃取物，結(jié)果顯示重組紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的轉(zhuǎn)化。體外酶促動(dòng)力學(xué)分析表明，兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變，并沒(méi)有影響到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性?；蚪MDNA雜交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因組中至少有4個(gè)拷貝。二、中藥青蒿鯊烯合酶的大腸桿菌表達(dá)、純化與功能鑒定將經(jīng)RACE方法克隆到的中藥青蒿鯊烯合酶cDNA(AF302464)開(kāi)放閱讀框的3’末端截短99bp，插入到原核表達(dá)載體pET30a(+)的NcoI和BamHI酶切位青蒿素生物合成相關(guān)基因的功能分析及

4、遺傳轉(zhuǎn)化研究點(diǎn)之間，構(gòu)建N端和C端均攜帶有HIS6表達(dá)標(biāo)簽的鯊烯合酶重組表達(dá)載體pETSSA。將pETSSA轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG(Isopropyl—beta-D—thiogalactoside)誘導(dǎo)重組鯊烯合酶的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖柱純化。純化蛋白加入酶促反應(yīng)體系(含F(xiàn)PP和NADPH)，GC，MS分析酶促反應(yīng)體系的正己烷萃取物，結(jié)果顯示重組鯊烯合酶可以催化FPP向鯊烯的轉(zhuǎn)化。青蒿鯊烯合酶的功能鑒定，為進(jìn)一步利用反義或RNM技術(shù)限制甾類生物合成，從而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基礎(chǔ)。三、中藥青蒿法呢醇合酶原核表達(dá)、純化與功能鑒定將經(jīng)RACE方法克隆到的中藥青蒿

5、倍半萜合酶eDNA(AF304444)開(kāi)放閱讀框插入到原核表達(dá)載體pET30a(+)的NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建N端和C端均攜帶有HIS6表達(dá)標(biāo)簽的重組表達(dá)載體pET30SESQ。將pET30SESQ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG(Isopropyl—beta-D-thiogalactoside)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖柱純化。純化蛋白加入酶促反應(yīng)體系(FPP)，GC．MS分析酶促反應(yīng)體系的正己烷萃取物，結(jié)果顯示此重組酶可以催化FPP向法呢醇的轉(zhuǎn)化。四、中藥青蒿FPS、ADS雙功能酶基因的構(gòu)建、表達(dá)與功能鑒定將青蒿素生物合成途徑中催化兩步連續(xù)反應(yīng)的酶：法呢

6、基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因進(jìn)行融合，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后鑒定融合蛋白的功能，結(jié)果表明融合蛋白具有了雙功能酶活性。進(jìn)一步將融合酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，發(fā)酵后檢測(cè)紫穗槐二烯的含量，并與同時(shí)轉(zhuǎn)入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶單個(gè)基因的酵母、單獨(dú)轉(zhuǎn)入紫穗槐二烯合酶基因的酵母進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入雙功能酶的酵母發(fā)酵獲得的紫穗槐二烯含量要比兩個(gè)對(duì)照酵母高，這表明，獲得的雙功能酶的催化效率要比兩個(gè)單獨(dú)酶的催化效率高。五、過(guò)量表達(dá)青蒿紫穗槐二烯合酶對(duì)青蒿中青蒿素及其前體物含量的影響利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將青蒿紫穗槐二烯合酶轉(zhuǎn)入青蒿株系001，分子檢測(cè)證明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因組中并在m

7、RNA水平得到了高效表達(dá)。II中文摘要部分轉(zhuǎn)基因青蒿的青蒿素含量有明顯增加，最多的比001株系提高了41％。青蒿酸和二氫青蒿酸含量測(cè)定表明，轉(zhuǎn)基因青蒿株系的青蒿酸和二氫青蒿酸含量最多的比對(duì)照分別提高了47％和79％。這些結(jié)果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途徑中是一個(gè)限速步驟，同時(shí)，也顯示青蒿酸或二氫青蒿酸的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步驟。關(guān)鍵詞：青蒿；青蒿素；紫穗槐二烯合酶；鯊烯合酶；法昵醇合酶；法呢基焦磷酸合酶；雙功能