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《嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖醋i基因的dna改組與酶學(xué)性質(zhì)的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的可再生資源。纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對(duì)于解決目前世界所面臨的糧食短缺、環(huán)境污染以及能源危機(jī)等問題具有十分重要的意義。纖維素酶可以將纖維素水解成為葡萄糖，這是一條無污染且能有效利用纖維素的途徑。但目前纖維素酶的成本仍較高，一些纖維素酶具有活性較低或熱穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)，通過定向進(jìn)化可以不斷提高并獲得新性能的重組纖維素酶。本試驗(yàn)以嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因曙，為研究對(duì)象，通過DNA改組技術(shù)對(duì)野生型餾，進(jìn)行突變重組，以期獲得高內(nèi)切葡聚糖酶活性、高穩(wěn)定性的突變菌株。本研究主
2、要結(jié)果：1．通過優(yōu)化DNaseI酶切時(shí)間、無引物PCR和有引物PCR的模板量等關(guān)鍵因素，建立適合于嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因改組的條件。2．以質(zhì)粒pMD．18T-egI為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得野生型曙，，利用DNAshuffling技術(shù)，得到大約400個(gè)突變克隆，隨機(jī)挑選20株進(jìn)行測(cè)序和序列分析，突變率達(dá)0．11％加．43％。3．將含有突變基因的重組質(zhì)粒pMD．18T-egI和酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K用SnaBI、NotI進(jìn)行雙酶切，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，抽提質(zhì)粒，獲得攜帶
3、不同片段的質(zhì)粒。線性化后，采用LiCl轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞中，MD平板上篩選Mut+His+轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)酶活測(cè)定，篩選出1株活性較高的菌株BY2，酶活為23．75U／mL，比出發(fā)菌株酶活提高了將近10倍。4．為得到高表達(dá)基因工程菌株，提取這株突變菌的基因組，以EG．S和EG-A為引物擴(kuò)增該突變基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該突變株為13號(hào)突變基因。突變基因與pPIC9K連接，線性化后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。通過活性篩選，得到高活性突變體BY213，在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)
4、168h后，酶活可達(dá)到78．63U／ml，蛋白含量達(dá)到1．14mg／mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS．PAGE電泳分析，分子量為34．1KDa。5．研究了BY213菌株的內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，其最適反應(yīng)溫度為65℃，最適pH值為3．5，在pH2．5~4．0仍表現(xiàn)出90％以上的酶活；55℃保溫30min，酶活保持85％以上，但在pH2．5～8．5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較低，僅保留40％65％的原酶活性。關(guān)鍵詞：內(nèi)切葡聚糖酶I；DNA改組；酵母表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)DNAshufflingofThermoascusaurandac
5、usEndo-p—glucanaseIGeneandthestudyofEnzymicPropertiesAuthor：BAIYuSupervisor：GUORun—fangMajor：．MicrobiologyAbstractCelluloseisthemostabundantandwidelydistrbutedrenewablebiopolymersonearth．thetransformationofcellulosehasveryimportantsignificanceforthesol
6、utionofenvironmentalpollutionandenergycrisisproblems．CellulosecanbehydrolyzedbyCellulasetoproduceglucose，anditisapollutionfreeandefficientuseofcelluloseapproach．Butcellulasehadsomedrawbackssuchashi．ghcost,lowactivityandthermalinstability．SOwewillimprov
7、eandobtainnewperformanceofeellulasebydirectedevolution．Inthisstudy,theThermoascusaurantiacusEndo-p-glucanaseIGeneWasmutatedtoobtainastrainwimlli曲CMCaseactivityandstabilityviashuffling．Themainresearchresultsarelistedbelow：1．111emethodisestablishedbyopti
8、mizingthetimeofDNaseIdigestionandthequantityoftemplateofprimerlessPCRandprimerPCR,whichadaptedtoshufflingofThermoascusaurantiacusEndo-p—glucanaseIGene．2．Thewide-typegeneofEndo—p-glucanaseI(eg，)wasamplifiedbyPCRfromplamidpMD18一T-egl。Abou
