嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖醋i基因的dna改組與酶學(xué)性質(zhì)的研究(7128)

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1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知,除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得塑主墾盛些盤鱟或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名:戧k簽字日期:&。,,年f月3,El學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解塑皇墾壅些盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤,允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑蘭堡盔些盤鱟可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編

2、入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名:瓴五導(dǎo)師簽名:簽字日期:劫,,年,月專,日簽字日期:如『1年jfl月羅1日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向:工作單位:通訊地址:電話:郵編:摘要纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的可再生資源。纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對于解決目前世界所面臨的糧食短缺、環(huán)境污染以及能源危機(jī)等問題具有十分重要的意義。纖維素酶可以將纖維素水解成為葡萄糖,這是一條無污染且能有效利用纖維素的途徑。但目前纖維素酶的成本仍較高,一些纖維素酶具有活性較低或熱穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn),通過定向進(jìn)化可以不斷提高并獲得新

3、性能的重組纖維素酶。本試驗(yàn)以嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因曙,為研究對象,通過DNA改組技術(shù)對野生型餾,進(jìn)行突變重組,以期獲得高內(nèi)切葡聚糖酶活性、高穩(wěn)定性的突變菌株。本研究主要結(jié)果:1.通過優(yōu)化DNaseI酶切時(shí)間、無引物PCR和有引物PCR的模板量等關(guān)鍵因素,建立適合于嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因改組的條件。2.以質(zhì)粒pMD.18T-egI為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得野生型曙,,利用DNAshuffling技術(shù),得到大約400個(gè)突變克隆,隨機(jī)挑選20株進(jìn)行測序和序列分析,突變率達(dá)0.11%加.43%。3.將含有突變基因的重組質(zhì)粒pMD.18T-egI和酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K用SnaBI、Not

4、I進(jìn)行雙酶切,經(jīng)T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,抽提質(zhì)粒,獲得攜帶不同片段的質(zhì)粒。線性化后,采用LiCl轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞中,MD平板上篩選Mut+His+轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)酶活測定,篩選出1株活性較高的菌株BY2,酶活為23.75U/mL,比出發(fā)菌株酶活提高了將近10倍。4.為得到高表達(dá)基因工程菌株,提取這株突變菌的基因組,以EG.S和EG-A為引物擴(kuò)增該突變基因,序列分析發(fā)現(xiàn)該突變株為13號突變基因。突變基因與pPIC9K連接,線性化后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。通過活性篩選,得到高活性突變體BY213,在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)168h后,酶

5、活可達(dá)到78.63U/ml,蛋白含量達(dá)到1.14mg/mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS.PAGE電泳分析,分子量為34.1KDa。5.研究了BY213菌株的內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì),其最適反應(yīng)溫度為65℃,最適pH值為3.5,在pH2.5~4.0仍表現(xiàn)出90%以上的酶活;55℃保溫30min,酶活保持85%以上,但在pH2.5~8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較低,僅保留40%65%的原酶活性。關(guān)鍵詞:內(nèi)切葡聚糖酶I;DNA改組;酵母表達(dá);酶學(xué)性質(zhì)DNAshufflingofThermoascusaurandacusEndo-p—glucanaseIGeneandthestudyofEnzymicProperties

6、Author:BAIYuSupervisor:GUORun—fangMajor:.MicrobiologyAbstractCelluloseisthemostabundantandwidelydistrbutedrenewablebiopolymersonearth.thetransformationofcellulosehasveryimportantsignificanceforthesolutionofenvironmentalpollutionandenergycrisisproblems.CellulosecanbehydrolyzedbyCellulasetoproducegl

7、ucose,anditisapollutionfreeandefficientuseofcelluloseapproach.Butcellulasehadsomedrawbackssuchashi.ghcost,lowactivityandthermalinstability.SOwewillimproveandobtainnewperformanceofeellulasebydirectedevolution.Inth

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