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《野生型mxa蛋白及其突變體抑制hbv復(fù)制活性研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、博士學(xué)位論文野生型MxA蛋白及其突變體抑锘IJHBV復(fù)制活性及意義博士研究生：余治健指導(dǎo)老師：駱抗先(教授)侯金林(教授)摘要研究背景MxA蛋白由662個(gè)氨基酸殘基組成，是大GTP酶蛋白超家族成員和動(dòng)力素超家族成員，分子量為76KD。MxA蛋白有GTP酶活性，即該蛋白有結(jié)合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通過N端氨基酸GTP結(jié)合元件結(jié)合外源性GTP；C端氨基酸含有GTP酶水解效應(yīng)區(qū)，能夠?qū)?nèi)源或外源GTP降解為GDP。MxA第83位氨基酸位于N端GTP結(jié)合元件的關(guān)鍵位點(diǎn)，K83A變異MxA
2、蛋白失去結(jié)合GTP的能力，但C端GTP酶水解效應(yīng)區(qū)仍能降解外源性GTP；第612位氨基酸位于MxA蛋白C端GTP酶水解活性區(qū)域，L612K變異MxA蛋白失去酶解內(nèi)源或外源GTP活性，但仍能通過N端GTP結(jié)合元件結(jié)合GTP。第103位氨基酸是位于MxA蛋白N端GTP結(jié)合元件的另一關(guān)鍵位點(diǎn)，T103A變異MxA同時(shí)失去結(jié)合GTP能力和水解GTP的活性。由于K83A、T103A和L612K位點(diǎn)變異MxA蛋白與GTP酶功能密切相關(guān)，因此，它們較多用于MxA蛋白GTP酶活性相關(guān)功能的研究。MxA蛋白抗RNA
3、病毒活性與其自身的GTP酶活性密切相關(guān)，即MxA蛋白可能在結(jié)合和分解GTP的同時(shí)發(fā)揮抗病毒作用。K83A位點(diǎn)變異不能抑制InfluenzaAvirus，Vesieularstomatitisvirus復(fù)制：T103A變異MxA蛋白失去對(duì)InfluenzaAvirus，Vesicularstomatitisvirus，Togotovirus的抑制作用；L612K變異MxA蛋白雖然失去了降解GTP的能力，能夠抑制Thogovirus和Vesicularstomatitisvirus的復(fù)制，但較野生型蛋
4、白抑制能力下降10倍。E645R變異發(fā)生在MxA蛋白C段GTP酶功能區(qū)域第二個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，該位點(diǎn)變異不影響GTPase活性(結(jié)合GTP和水解GTP的能力均不受影響)，但特中文摘要異性的失去抗LACV(Iacrossvirus)、CCHFV(crimean—congohemorrhagicfevervirus)活性和VSV活性而保留對(duì)InfluenzaAvirus和THOV(Thogotovirus)的抑制活性。近年有報(bào)道MxA蛋白對(duì)DNA病毒乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV
5、)也有明顯的抑制作用，但GTP酶活性是否對(duì)MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性有著關(guān)鍵性的影響尚不清楚。體外研究表明MxA蛋白特異性的干擾RNA病毒核殼組裝和形成可能是其發(fā)揮抗病毒作用的主要機(jī)理，但MxA并不能直接與HBV核殼蛋白相互作用；MxA抑制HBV復(fù)制的過程中對(duì)病毒總RNA水平?jīng)]有影響，但導(dǎo)致核內(nèi)前基因組RNA(pregenomie3．5kbmRNA，pgRNA)增多而胞漿分布明顯減少，推測(cè)MxA蛋白可能通過抑制pgRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)從而抑制HBV復(fù)制；乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(Hepati
6、tisBvirusposttranscriptionalregulatoryelement，HPRE)是介導(dǎo)pregenomic3．5kbmRNA核外移的關(guān)鍵元件之一，體外實(shí)驗(yàn)表明MxA可作用于HPRE序列介導(dǎo)的mRNA核外移；推測(cè)MxA蛋白可能通過影響HPRE介導(dǎo)的pgRNA核外移從而影響HBV蛋白合成、包裝和抗原的分泌。但MxA蛋白是否在核內(nèi)或核周發(fā)揮這一作用?通過提高核內(nèi)核周MxA蛋白濃度是否能提高其抑制HBV復(fù)制能力?這些問題尚未見報(bào)道。研究目的l、研究MxA蛋白在Hep02細(xì)胞中抑制HB
7、V復(fù)制活性。2、E645R變異是否影響MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性。3、GTP酶活性是否是影響MxA蛋白抑制HBV復(fù)制的關(guān)鍵因素。4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核內(nèi)復(fù)制階段。研究方法l、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表達(dá)載體的鑒定：peDNA3．1．Flag-MxA(wild—type)，peDNA3．1-Flag-MxA-K83A，peDNA3．1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3．1．Flag．MxA-L612K重組載體轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽性克隆，經(jīng)過PCR鑒定和雙酶切鑒定
8、后進(jìn)一步測(cè)序鑒定；測(cè)序結(jié)果與pubmed公布序列通過DNAsis軟件比II博士學(xué)位論文對(duì)。用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)中量抽提以上各質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3．1(+)。2、野生型MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性研究：用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)大量抽提重組質(zhì)粒pUl9-1．24HBV。常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。按5×106細(xì)rft／ml將細(xì)胞接種到直徑10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后待轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方案采用pcDN
