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《牛輪狀病毒vp4基因的克隆與原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要本研究以G6型牛輪狀病毒CHLY株的總RNA為模板，應用RT—PCR技術(shù)擴增牛輪狀病毒VP4基因，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pEASY—T3載體中，成功構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pEASY-T3-VP4。經(jīng)雙酶切后再將該基因重組于原核表達載體pET32a(+)中，構(gòu)建出原核表達質(zhì)粒pET32a-VP4。同時，以pET20b—LTB為模板PCR擴增出LTB基因，以同樣的方法構(gòu)建出原核表達質(zhì)粒pET32a—VP4一LTB。將pET32a—VP4和pET32a-VP4一LTB分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導和SDS—PAGE分析，可見約108．4
2、KD和115KD的融合蛋白帶，而未誘導的對照菌株沒有出現(xiàn)相應的條帶，即成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達VP4蛋白的基因工程菌株。對CHLY株VP4基因進行了核酸序列測定和基因?qū)Ρ?，結(jié)果表明該病毒株的P血清型為P【1】型。將純化的VP4融合蛋白和VP4-LTB融合蛋白作為抗原經(jīng)過肌肉注射免疫小鼠，并以純化的pET32a的His-tag為對照，免疫7周后VP4融合蛋白和VP4一LTB兩個融合蛋白免疫組的血清牛輪狀病毒VP4IgG抗體效價分別為8．1X103和16．3×103，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者沒有顯著差異(P>0．05)，而與對照組具有顯著差異(P<0．05)。免疫母鼠所生小鼠在
3、出生后4天，用10L2TCID柏輪狀病毒CHLY株100IIL進行腹腔攻毒，攻毒后第3"--7天對照組小鼠出現(xiàn)了典型的腹瀉癥狀，保護率為0，而經(jīng)過VP4蛋白免疫的母鼠所生的小鼠保護率為90％，經(jīng)過VP4-LTB融合蛋白免疫的母鼠所生的小鼠保護率為94％。關(guān)鍵詞：牛輪狀病毒；VP4；粘膜佐劑；LTB；原核表達CloneandProkaryoticexpressionofVP4GeneofBovineRotavirusAbstractBovinerotavirusesalenonenveloped，segmented，doublestrandedRNAvirusescl
4、assifiedinthefamilyReoviridae．Bovinerotavirusesalethemajorcauseofdiarrheainthepiglets．Bovinerotavirushasbeenwidelydistributedintheworldandcostpigproducersseriousloss．InordertoconstructtheprokalyoticexpressionvectorpET32a-VP4，totalRNAwereextractedformMAl04cellinfectedwithbovmerotavimsG6
5、strainCHLYisolatedbyourlaboratory．TheopenreadingframeofVP4(2331bp)WasamplifiedbyRT-PCRandclonedintopEASY-T3vectorusingT-AcloningtechniqueVP4geneWassubclonedintotheexpressionvectorpET32aandtransformedintoEcoliBL21(DE3)．SDS·PAGEshowedthatthebacteriuminducedbyIPTGsuccessfullyexpressed，app
6、roximately108KDexogenousproteinWasobservedontheSDS-PAGE．TheresultsindicatethatthefusionproteinisofantigenicexpectedtolayfoundationforfurtherstudiesofthesubtmitvaccineandDNAvaccineandtopreventionofbovinerotavims．Keyword：BovineRotavims：VP4；MucosalAdiuvant；ProkaryoticexpressionDirectedby：
7、Prof．SHENZhiyi(veterinary)ApplicantforMasterdegree：NANXiaowei(veterinary)(Thecollegeofveterinaryandanimalscience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018，China)縮略詞表內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學研究生學位論文獨創(chuàng)聲明本人申明所呈交的學位論文是我本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括為獲得我?；?/p>
