sirna沉默livin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長及其凋亡的影響

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1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文siRNA沉默I-Vin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長及其凋亡的影響碩士研究生：陳鵬導(dǎo)師：孔令斌副教授楊景玉教授中文摘要背景和目的胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一㈣3，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時己處中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)，只能進(jìn)行保守治療，而保守治療的效果往往不能令人滿意，其原因是多方面的，但腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制異常引起的凋亡抵抗被認(rèn)為是對化療、放療藥物不敏感的重要因素，因此從凋亡異常的發(fā)生機(jī)制著手，尋找逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞凋亡抵抗的靶點(diǎn)將會成為胃癌治療的新的研究方向。有研究表明，凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族是獨(dú)立于Bcl-2的細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋

2、白家族，包括多種蛋白，其中l(wèi)ivin是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制基因成員佑哪，它們在凋亡的調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。研究表明，腫瘤細(xì)胞中的IAP表達(dá)往往上調(diào)，通過阻斷或拮抗IAP的功能重新恢復(fù)惡性腫瘤(包括胃癌)對凋亡刺激劑(包括化療藥物)的敏感性，因此如果能夠抑制livin基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，將會恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性，大大提高腫瘤的治療效果。目前國內(nèi)外關(guān)于Livin的研究較少，且有資料顯示Livin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，Livin基因在胃癌的中所扮演的角色國內(nèi)外研究亦不多，值得我們深入研究。RNAi(RNAinterference)技術(shù)是近年發(fā)展起來的基因

3、沉默技術(shù)陽1，能夠利用雙鏈RNA(dSRNA)特異性地降解與其同源的mRNA序列，阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。并且能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。因此探討小干擾RNA(siRNA)對胃癌細(xì)胞livin基因表達(dá)的基因沉默(genesilencing)作用，有望為胃癌的治療提供一種新的思路和方法。為此，本研究通過自行設(shè)計(jì)了靶向沉默Livin的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株BCG-823山東火學(xué)碩十學(xué)位論文中來抑制Livin的表達(dá)，然后檢測轉(zhuǎn)染前后胃癌BCG一828細(xì)胞的增值能力及凋亡敏感性的變化，觀察siRNA對胃癌BGC一823細(xì)胞株livin基因的表達(dá)

4、影響，以探討siRNA在腫瘤細(xì)胞生長、凋亡中的作用，為探索siRNA沉默livin基因抑制胃癌的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。方法1．利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，掃描人livin(1ivinQ和1ivin13)cDNA編碼序列，依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，經(jīng)BLAST同源性分析選擇確定19個堿基的siRNA靶序列，同時隨機(jī)組合出一條對照序列。設(shè)計(jì)并化學(xué)合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向livin基因的寡核苷酸，再退火，克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的siRNA表達(dá)載體啟動子的下游，重組構(gòu)建RNAi質(zhì)粒同時設(shè)立非特異性對照，干擾

5、載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測序鑒定。2．脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC一823后用G418篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系；觀察細(xì)胞形態(tài)，采用半定量RT—PCR檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞BGC一823mRNA水平，比較不同組別的mRNA水平。3．用四氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞增殖凋亡；熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其轉(zhuǎn)染綠。結(jié)果1．通過同源序列檢索和進(jìn)一步優(yōu)選，確定了19個堿基為siRNA靶序歹0：GCGTCTGGCCTCCTTCTAT(440--一458)和GTCTGGCCTCCTTCTATGA(442"-,460)。2．siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見明亮條帶

6、，均位于約lOObp處，與設(shè)計(jì)完全一致。3．對胃癌細(xì)胞株BGC一823真核表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)行酶切和序列分析，發(fā)現(xiàn)酶切圖譜及插入序列與預(yù)期結(jié)果一致。4．轉(zhuǎn)染siRNA組Livina／BmRNA(0．11±O．07，0．13+0．04)表達(dá)明顯低于空白對照組(O．37-4-0．10，0．43±O．09)芹11空siRNA載體組(O．344-0．08，0．45±0．11，P

7、．轉(zhuǎn)染siRNA組的細(xì)胞的凋亡率(14．85±1．35)明顯高于空白對照組(4．51±O．36)和轉(zhuǎn)染空siRNA載體組(5．13_+0．71)，兩組差異有顯著性(P<0．05)。結(jié)論1．成功構(gòu)建出針對livin的siRNA表達(dá)載體。。2．靶向siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后能顯著降低livin基因的表達(dá)。3．Livin基因與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，siRNA沉默livin基因能抑制胃癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋