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《擬南芥ros1突變抑制因子篩選、基因克隆及其功能的分析》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要外源基因插入到植物基岡組中會引起本身或相關(guān)的內(nèi)源基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默的過程通常是由外源基閃產(chǎn)生siRNA,再由這些siRNA介導(dǎo)DNA甲基化及組蛋自修飾變化等來實(shí)現(xiàn)。擬南芥中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),很多RNAi過程中的組件、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等參與到這一過揮中。擬南芥中編碼DNA糖基化酶的ROSl基因突變后能夠使多拷貝的轉(zhuǎn)基因PrOp,D29A:£LE和內(nèi)源RD29A基因的啟動子區(qū)發(fā)生超甲基化,從而使內(nèi)源RD29A基因及外源££,c轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默現(xiàn)象,而與其相鄰的轉(zhuǎn)基因
2、Proj5S:NPTll的啟動子區(qū)的甲基化雖沒有發(fā)生變化但卻同樣表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的基岡沉默。ROSI基因作為一種DNA去甲基化酶參與抑制轉(zhuǎn)錄基因沉默過程中。利j={{jrosl突變體中沉默的Pr03jsjNPz噼}基因作為篩選標(biāo)記,我們從EMS誘變的rosl后代中篩選到了一系YOrost突變的抑制因子,其中ror](suppressorofrosl)突變體包括兩個等位突變,rorl一』}Hrorl.2。RORl基因的突變能夠使rosl突變背景中處丁沉默狀態(tài)的Proj珂ⅣPH,基因恢復(fù)表達(dá),但是對PrORO?¨jLUC基因的沉
3、默狀態(tài)卻沒有影響。基岡組亞硫酸氫鹽測序及擬南芥基因組SouthemBlot分析結(jié)果顯示突變體中RD29A啟動子區(qū)整體甲基化情況不受rorl突變的影響,并且基岡組中rDNA區(qū)和著絲粒區(qū)的DNA甲基化也不受rorl突變的影響。另外,NorthernBlot分析發(fā)現(xiàn)rorlrosl突變體中內(nèi)源轉(zhuǎn)座子T研的表達(dá)量卻比rosl突變體和C24野生型(rosl突變體的背景)都高。通過對轉(zhuǎn)基因Proj5S:NPTII的啟動子區(qū)的甲基化及組蛋閂修飾的分析顯示,雖然C24野生型,rosl突變體及roslrorl)f)【突變體中轉(zhuǎn)基因Pr03Ⅱ
4、jNP弛珀勺3船啟動子區(qū)甲基化情況沒有變化,但是相對于roM突變體,rorlrosI突變體中該區(qū)域組蛋白H3.K9的二甲基化程度降低了,而組蛋白H3的乙?;潭葎t升高了。這說明rorl突變引起的轉(zhuǎn)基岡PmJ镕j.ⅣPm區(qū)域基因沉默的釋放與DNA甲基化變化無關(guān)而與組蛋白的修飾狀態(tài)的變化有關(guān)。另外,rorlrosl突變體表現(xiàn)出明顯的發(fā)育上的異常表型,如植株矮小、早花等,一些突變體在發(fā)育晚期還出現(xiàn)末端花結(jié)構(gòu)異常的表型?;蚨ㄎ坏慕Y(jié)果顯示尺。尺』基因編碼一個擬南芥DNA復(fù)制蛋(:tA2(RPA2A,At2924490)。RORl/
5、RPA2A基因在根失及莖尖的分生組織表達(dá)量較高。RORl/RPA2A基因突變會影響根尖及莖尖頂端分生組織細(xì)胞的分裂,但是對細(xì)胞最終的大小沒有影響。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,RoRl,RPA2A蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi),該基因突變后突變體植株對DNA烷化劑甲基甲磺酸(MMS)超敏感,說明RORI/RPA2A基因在DNA修復(fù)過程中起重要作用。由丁二ROSl蛋白也具有DNA修復(fù)的活性,并且酵母般雜交體外實(shí)驗(yàn)證明了RORl/RPA2A蛋白與ROSl蛋向的互作關(guān)系,我們推測RoRl/RPA2A蛋白的DNA修復(fù)功能很可能與ROSl蛋白相關(guān),而其在
6、基因沉默方面的調(diào)節(jié)功能則具有相對獨(dú)立性。我們的研究揭示了擬南芥DNA復(fù)制蛋白A2在維持特殊區(qū)域的組蛋向修飾模式和轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默過程中以及在擬南芥頂端分生組織發(fā)育過程中的重要作用。關(guān)鍵詞:DNA甲基化,組蛋白修飾,rosl突變體,rorlrosl突變體,RORl/RPA2A基因,ROSl基因AbstractTheforeigngenesintegratedintoplantgenomesandtheirendogenoushomologousgenesoftenbecomesilencedatthetranscripti
7、onallevel.ThiskindoftranscriptionalgenesilencingisusuallytriggeredbysiRNAsderivedfromtheforeigngenes.RNA-directedDNAmethylationandhistonemodificationareinvolvedinthisprocess.ManylinesofevidencesuggestthatsomeenzymesasRNAprocessingfactors,DNAmethyltransferasesandhi
8、stonemethyltransferasesareinvolvedintranscriptionalganesilencing.MutationsinaDNAglycosylase/lyasegeneROSlcausetranscriptionalgenesilencingofthePrORD29A.