蛋氨酸腦啡肽對小鼠樹突狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)和功能調(diào)控機(jī)制的研究

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1、·中文論著摘要·蛋氨酸腦啡肽對小鼠樹突狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)和功能調(diào)控機(jī)制的研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^蛋氨酸腦啡肽(MENK)在體內(nèi)外對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(Dc)亞群分化的誘導(dǎo)，樹突狀細(xì)胞免疫表型、生物學(xué)活性、抗原提呈功能的調(diào)控，從而探討MENK調(diào)控鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞分化、誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答及抗腫瘤的作用的機(jī)制。為進(jìn)一步發(fā)掘DCs的免疫潛能，使其在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮最大作用奠定基礎(chǔ)，繼而為腫瘤的治療提供廣闊的前景。實(shí)驗(yàn)方法首先，研究蛋氨酸腦啡肽對小鼠樹突狀細(xì)胞亞型分化的誘導(dǎo)及調(diào)控。從7．8周齡的C57BL／6小鼠骨髓提取骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)CDllc免疫磁珠分選，獲得純化的樹突狀細(xì)胞。流式細(xì)

2、胞儀分析表明，CDllc(樹突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)記)陽性細(xì)胞純度達(dá)85％以上。采用倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度的(1礦．10。14tool／L)MENK體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的形態(tài)變化，采用流式細(xì)胞儀分析梯度濃度的MENK體外誘導(dǎo)骨髓樹突狀細(xì)胞前體后其CDllc+CDllbq3C和CDllc+CDllb‘CD45R／B220+DC亞群的變化規(guī)律和固定量的MENK(20mg／kg注射量)體內(nèi)誘導(dǎo)DC亞群分化的特點(diǎn)，以及體內(nèi)外共刺激分子CD80，CD40和MHC．11分子的表達(dá)進(jìn)而確定MENK體外最佳誘導(dǎo)濃度。其次，研究蛋氨酸腦啡肽對樹突狀狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的調(diào)控。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA

3、)法，檢測了不同體外誘導(dǎo)條件下，各組骨髓樹突狀細(xì)胞前體來源的樹突狀細(xì)胞上清中的IL．12p70和IL-IO含量，進(jìn)而從誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的特點(diǎn)判斷MENK對1111廠T112型反應(yīng)的定向調(diào)控；同時(shí)用RT-PCR的方法檢測了各組誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞其K，6，p阿片受體及細(xì)胞內(nèi)TNF噸和TLR．4的mRNA水平；在誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，用MTr法測定了T淋巴細(xì)胞的增殖能力；采用MTT法配合倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)測定了10～2mol／LMENK(MENK-12)，LPS，IL．3，G+I誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的對MCF．7腫瘤細(xì)胞的抑制率及體外凋亡的情況

4、；同時(shí)采用了Western．Blot檢測了體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞凋亡蛋圭tTRAIL蛋白的分泌情況。在體內(nèi)試驗(yàn)中，制備了荷瘤鼠模型，在MENK(20mg／kg乏jZ射量)的作用下，采用流式細(xì)胞儀檢測了體內(nèi)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤凋亡的能力并比較了小鼠的生存率、抑瘤率；同時(shí)將用MENK．12體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行了體內(nèi)回輸檢測其生存率、抑瘤率。最后，在MENK對樹突狀細(xì)胞亞群分化誘導(dǎo)及免疫學(xué)功能調(diào)控的的基礎(chǔ)上，迸一步探討了MENK對樹突狀細(xì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR-4-NF．曲信號活化的意義。用Westen．Blot的方法，定量檢測了MENK對樹突狀細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白NF．Kb和TLR．

5、4的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、在樹突狀細(xì)胞亞群分化方面，無論是在體內(nèi)還是在體外，MENK均定向的誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞像髓系發(fā)展，在體外誘導(dǎo)中，在mENK濃度為10-12mol／L的時(shí)，共刺激分子CD80，CD40，MHCII達(dá)到最高值，表明MENK是最佳誘導(dǎo)濃度是10～2mol／L。2、ELISA結(jié)果表B刃MENK-12(10-1'mol／LMENK)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌的IL一12p70的含量高于IL-10，表明MENK一12能夠定向誘導(dǎo)THl型反應(yīng)，RT-PCR的結(jié)果表明，經(jīng)MENK-12誘導(dǎo)的的樹突狀細(xì)胞能夠上調(diào)阿片受體及細(xì)胞內(nèi)TNF—Q和TLR-4的mRNA水平。Western-Blot

6、檢測結(jié)果證實(shí)了MENK-12增加了樹突狀細(xì)胞分泌TRAIL蛋白的的能力。MTT結(jié)果表明MENK-12能夠刺激樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力，流式結(jié)果表明MENK在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死并可以顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間，其生存率明顯高于模型對照組。3、Western-Blot結(jié)果表明MENK一12能夠上調(diào)骨髓樹突狀細(xì)胞前體來源的樹突狀細(xì)胞TLR-4的表達(dá)，從而活化了NF-Kb信號通路。結(jié)論1、MENK能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞向髓系分化，并且上調(diào)共刺激分子的表達(dá)。2應(yīng)。2、MENK能夠上調(diào)樹突狀細(xì)胞的免疫學(xué)功能，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。3

7、、MENK可以活化TLR一4_NF—Kb信號通路增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)免疫反關(guān)鍵詞蛋氨酸腦啡肽；樹突狀細(xì)胞；亞群分化；腫瘤3·英文論著摘要·Regulationondifferentiationandfunctionofmurineofdendriticcellbymethionineenkephalin(MENK)objectiveThisworkistoinvestigatetheeffectsofMENKOndifferentiation，immuno-ph朗otype